降钙素基因相关肽转基因小鼠的建立及血压动态分析

鲍 丹,董 伟,张 旭,刘 宁,高 珊,张海涛,高 翔,葛文平,吕 丹

（中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

降钙素基因相关肽转基因小鼠的建立及血压动态分析

鲍 丹,董 伟,张 旭,刘 宁,高 珊,张海涛,高 翔,葛文平,吕 丹

（中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

目的 建立降钙素基因相关肽α（calcitonin gene-related peptide，CGRPα）和β（CGRPβ）转基因小鼠，并对其血压进行动态对比分析，建立可用于高血压研究的动物模型。方法 把人CGRPα和CGRPβ基因分别插入鸡β-肌动蛋白启动子下游，构建转基因表达载体，显微注射法建立C57BL/6JCGRPα和CGRPβ转基因小鼠，PCR鉴定转基因小鼠基因型。采用Western Blot鉴定CGRPα和CGRPβ在心脏、肺、肾脏和肝脏组织中的表达，筛选高表达转基因品系。用无创血压测量仪分析转基因小鼠动态血压变化。结果 建立了在心脏、肺、肾脏和肝脏组织中均高表达CGRPα基因的CGRPα转基因小鼠；在肺和肝脏组织中高表达CGRPβ基因的CGRPβ转基因小鼠。CGRPα转基因小鼠血压正常，CGRPβ转基因小鼠在12月龄时表现出显著的血压降低。结论 CGRPα和CGRPβ转基因小鼠可作为用于CGRP对外周血管阻力和高血压抵抗机制研究的动物模型。

CGRP；转基因；外周血管阻力；高血压抵抗

动脉血压的形成有赖于循环系统内足够的血液充盈、心脏射血和外周阻力三种因素的相互作用。影响动脉血压的因素包括每搏输出量、心率、外周阻力、大动脉管壁的弹性和循环血量与血管系统容量的比例，其中，外周阻力增大是慢性高血压患者血压升高的原因之一［1-3]。外周血管阻力主要受交感神经肾上腺素能神经和非肾上腺素能非胆碱能（nonadrenergic noncholinergic，NANC）血管扩张神经共同调控［4-5]。降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一种主要的NANC血管扩张神经的神经递质［6]，在神经内分泌细胞、感觉C纤维［7]、肺的淋巴组织［8]、心脏和血管［9]中表达。自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）和高血压患者体内 CGRP水平显著降低［10-11]。研究发现，CGRP对心血管系统具有保护作用，如抗高血压、抗血小板聚集和抗缺血-再灌注损伤等［12-14]。哺乳动物的 CGRP有 CGRPα和CGRPβ两个亚型，分别由同一个染色体上的两个独立的基因编码，两个亚型的第3、22和25位上的氨基酸序列不同，但二者的生物学功能相似［15-17]。研究证实，CGRPα基因敲除小鼠平均动脉血压（mean arterial pressure，MBP）显著升高［18]。在日本人群中，CGRPα是原发性高血压的易感基因［19]。

基于上述研究结果，本研究拟通过建立CGRPα和CGRPβ转基因小鼠，并对其血压进行动态分析，为研究CGRP与高血压发病机制的关系提供动物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

C57BL/6J小鼠和ICR小鼠均购自北京市维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-0001】。CGRPα和CGRPβ转基因小鼠由本实验室制作。本实验所用动物均在屏障设施的饲养间【SYXK（京）2009-0003】饲养，饲养间温度23±2℃，12：12 h明/暗灯照，动物自由饮水和摄食。实验中涉及动物操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准（ILAS-GC-2012-001）。

1.1.2 主要试剂及仪器

限制性内切酶以及PCR相关试剂均购自中国宝生物工程有限公司。PCR引物由中国上海英俊生物技术有限公司合成。NC膜购自 Millipore公司。鼠抗 CGRPα和 CGRPβ抗体均购自德国Abnova公司。HRP-偶联的羊抗鼠抗体和HRP-偶联的GAPDH单克隆抗体均购自中国康成生物公司。BP-98A智能无创血压计购自日本 SoftronTM公司。普通维持饲料购自中国军事科学院。

1.2 方法

1.2.1 CGRPα和 CGRPβ表达载体的构建及转基因

以pCR4-TOPO-h-CGRPα质粒（GE healthcare，美国，Clone ID 7939598）为模板，用PCR法扩增人CGRPα全长 cDNA，上 游 引 物 为：5’CCCT CGAGCAGAGAGGTGTCATGGGCTTC，下游引物为：5’CGGAATTCGGAAAGGGAGGAGTTTAGTTGGC。反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，重复变性到延伸29次，完成30个循环。目的基因人CGRPα片段为452 bp。将扩增片段插入pMD18T载体，经测序并比对正确后，以Xho I和EcoR I酶切回收CGRPα片段，并克隆入CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子下游构建全身表达人CGRPα表达载体。提取并酶切鉴定质粒正确后，再用Pvu II将其线性化，Sephedex G50柱纯化DNA片段，获得CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动的人CGRPα基因的转基因片段，注射前将转基因片段浓度调整至5 ng/μL，用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。

以pDNR-LIB-h-CGRPβ质粒（GE healthcare，美国，Clone ID 4287225）为模板，用 PCR法扩增人CGRPβ全长 cDNA，上游引物为：5’CCCTCGAG AGAGGCGGCATGGGTTTC，下游引物为：5’CGGAA TTCGTCATTCATCTGCTCAGGCTTG。反 应 条 件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，重复变性到延伸29次，完成30个循环。目的基因人CGRPβ片段为406 bp。将扩增片段插入 pMD18T载体，经测序并比对正确后，以Xho I和EcoR I酶切回收CGRPβ片段，并克隆入CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子下游构建全身表达人CGRPβ表达载体。提取并酶切鉴定质粒正确后，再用Pvu II将其线性化，Sephedex G50柱纯化DNA片段，获得CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动的人CGRPβ基因的转基因片段，注射前将转基因片段浓度调整至5 ng/μL，用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。

1.2.2 PCR鉴定CGRPα和CGRPβ转基因小鼠的基因型

转基因小鼠在出生后9～14 d用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组DNA，用PCR法对转基因小鼠进行基因型检测。CGRPα上游引物为：5’CTCTCAGCATCTTGGTCCTG，下游引物为：5’GGTCTCTCTCCAAGTCGCT；CGRPβ上游引物为：5’ATGGGTTTCCGGAAGTTCT，下游引物为：5’AGGCTTGAAGGTCCCTGC。PCR反应体系为 20 μL。反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，重复变性到延伸29次，完成30个循环。目的基因CGRPα片段为357 bp，目的基因CGRPβ片段为384 bp。

1.2.3 Western blot鉴定CGRPα和CGRPβ蛋白的表达

提取首建鼠仔代阳性转基因小鼠和同窝转基因阴性（non-transgenic，NTG）小鼠心脏、肺、肾脏和肝脏组织总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白转移至 NC膜上，置于 5％脱脂奶粉中封闭，鼠抗CGRPα和CGRPβ抗体检测鼠源CGRPα和CGRPβ以及转入的人源CGRPα和CGRPβ蛋白的表达水平，HRP-偶联的羊抗鼠抗体结合一抗，HRP-偶联的GAPDH单克隆抗体作为内参。用Image J分析软件测定Western Blot条带灰度。

1.2.4 智能无创血压计测量CGRPα和CGRPβ转基因小鼠血压

将待测小鼠提前半小时放入血压测量实验室，让小鼠适应测试环境。按智能无创血压计说明书［20]和Steven E.［21]报道的方法于2、4、8和12月龄进行小鼠尾部血压测量。

1.2.5 统计分析

实验数据以Mean±S.E.M.表示，用one-way ANOVA分析处理数据，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 CGRPα转基因小鼠的建立

测序结果表明PCR法克隆的片段同已报道人组 织 CGRPα 序 列 完 全 一 致 （GeneBank：BC093753.1），将人CGRPα基因插入CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子下游，构建得到人CGRPα转基因表达载体（图1A）并用显微注射法制备转基因小鼠。提取小鼠基因组DNA，用PCR法扩增357 bp的CGRPα基因目的片段，鉴定小鼠基因型（图1B）。提取小鼠心脏、肺、肾脏和肝脏组织总蛋白，用CGRPα抗体进行Western Blot分析，确定转基因小鼠CGRPα的高表达（图1C）。Image J软件分析条带灰度，定量分析CGRPα蛋白表达量（图1D）。通过分别比较NTG和转基因小鼠中CGRPα表达水平，筛选到在心脏、肺、肾脏和肝脏组织中都高表达CGRPα基因的转基因小鼠品系。

2.2 CGRPβ转基因小鼠的建立

测序结果表明PCR法克隆的片段同已报道人组 织 CGRPβ 序 列 完 全 一 致 （GeneBank：BC008428.1），将人CGRPβ基因插入CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子下游，构建得到人CGRPβ转基因表达载体（图2A）并用显微注射法制备转基因小鼠。提取小鼠基因组DNA，用PCR法扩增384 bp的CGRPβ基因目的片段，鉴定小鼠基因型（图2B）。提取小鼠肺和肝脏组织总蛋白，用CGRPβ抗体进行Western Blot分析，确定转基因小鼠CGRPβ的高表达（图2C）。Image J软件分析条带灰度，定量分析CGRPβ蛋白表达量（图2D）。通过分别比较NTG和转基因小鼠中CGRPβ表达水平，筛选到在肺和肝脏组织中都高表达CGRPβ基因的转基因小鼠品系。

2.3 CGRPα和CGRPβ转基因小鼠血压动态对比分析

于2、4、8和12月龄对NTG和转基因阳性小鼠进行血压动态分析。结果显示，NTG和转基因阳性小鼠MBP［MBP=舒张压+1/3（收缩压-舒张压）]整体均呈现随着年龄的增长而逐渐升高的表型。与NTG小鼠（2、4、8和12月龄样本量分别为n =8，9，8和10）相比，CGRPα转基因小鼠（2、4、8和12月龄样本量分别为n=7，11，8和14）并未出现明显的血压降低，CGRPβ转基因小鼠（2、4、8和12月龄样本量分别为 n=7，12，8和11）在12月龄时MBP显著降低（P=0.026，图3）。

3 讨论

高血压是严重危害人类健康的常见心血管病之一，目前全球高血压患者约有10亿，预计到2025年，全球的高血压患者人数可能会再增加80％［22]。此外，高血压还是脑卒中、心肌梗死等心血管疾病以及慢性肾脏疾病等最主要的危险因素。高血压已经成为威胁人类生命健康的重要的公共卫生问题，其防治具有重要的现实意义。

图1 CGRPα转基因小鼠的建立Note：A. Establishment of CGRPα transgenic vector；B.Genotyping of CGRPαtransgenic mice by PCR；C.Expression level of CGRPαin the heart，lung，kidney and liver tissues of CGRPα transgenic mice by Western Blot；D.Quantitative analysis of the CGRPαexpression level（n=3 independent experiment）.Fig.1 Establishment of CGRPαtransgenicmice

图2 CGRPβ转基因小鼠的建立Note：A. Establishment of CGRPβ transgenic vector；B.Genotyping of CGRPβtransgenic mice by PCR；C.Expression level of CGRPβ in the lung and liver tissues of CGRPβ transgenicmice by Western Blot；D.Quantitative analysis of the CGRPβexpression level（n=3 independent experiment）.Fig.2 Establishment of CGRPβtransgenicmice

外周血管阻力的增大致使慢性高血压患者的血压持续升高［3]，外周阻力调控系统的功能障碍可能是慢性高血压的主要病因之一［23]。研究发现，交感血管收缩神经的兴奋性增强是外周血管阻力增大的一个重要因素［24]。交感神经肾上腺素能神经通过释放神经递质—去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）调控外周血管阻力，一方面，NE可引起血管极度收缩，外周血管阻力增加，血压升高；另一方面，NE还可通过激活突触前α2-肾上腺素能受体抑制CGRP包含神经释放具有血管扩张效应的CGRP［25]。此外，与NE共定位于外周肾上腺素能神经的血管收缩神经肽-Y亦可抑制神经性的血管扩张和CGRP的释放［26]。CGRP已被证实是一种强而有效的血管扩张神经肽［27]。CGRP包含神经的功能障碍和CGRP的释放抑制增强了交感血管收缩神经的兴奋性，使得血压进一步升高。

图3 CGRPα和CGRPβ转基因小鼠血压动态对比分析Note：*P＜0.05.Fig.3 Contrastive analysis of dynamic changes of blood pressure in CGRPαand CGRPβtransgenicmice

本文建立了人CGRPα和CGRPβ转基因小鼠，并对其进行血压动态对比分析。结果发现，与NTG小鼠相比，CGRPα转基因小鼠血压正常，CGRPβ转基因小鼠在12月龄时出现平均动脉压的显著降低。研究发现，CGRPα是人甲状腺髓样癌的主要降钙素基因产物，而CGRPβ是人正常组织中的主要CGRP成分［28]；再者，CGRP对阻力血管的调控效应随着年龄的增长逐渐减弱［4]，外源性的 CGRP能抑制CGRP包含神经的血管扩张效应［29]。这可能是CGRPβ转基因小鼠仅在12月龄表现血压降低的原因。小月龄时，内源性CGRP的血管扩张效应足以维持外周阻力的平衡，外源性CGRP的效应被抑制，血压维持正常水平；随着年龄的增长，内源性CGRP对外周阻力的调控能力逐渐减弱，此时，外源性CGRP发挥血管扩张功能，CGRP转基因小鼠外周血管阻力减小，血压下降。此外，有研究报道，CGRPα基因敲除小鼠MBP显著升高［18]，而本文建立的人CGRPα转基因小鼠在未经病理刺激时血压表现正常，推测，CGRPα转基因小鼠在给予压力负荷等病理刺激后，抵抗高血压的能力会显著增强。

尽管外周阻力调控系统中CGRP神经的功能抑制对高血压的维持和发展至关重要，但CGRP包含神经功能的减弱的潜在机制仍不清楚。近期研究发现，SHR 肠系膜动脉中的血管紧张素 II （angiotensin II，Ang II）可通过 Ang II受体抑制CGRP包含神经的神经传导［30]，长期抑制肾素-血管紧张素系统可阻止或恢复CGRP包含神经的功能减弱和重构［31]。

综上所述，CGRP与外周血管阻力的调控密切相关，本文建立的CGRPα和CGRPβ转基因小鼠为CGRP对外周血管阻力和病理刺激下的高血压抵抗机制的研究提供了理想的动物模型。

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Establishment and dynam ic analysis of blood pressure in calcitonin gene-related peptide transgenic m ice

BAO Dan，DONGWei，ZHANG Xu，LIU Ning，GAO Shan，ZAHNG Hai-tao，GAO Xiang，GEWen-ping，LV Dan
（Institute of Laboratory Animal Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences Comparative Medicine Center，Key Laboratory of Human Diseases Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Peaking Union Medical College，Beijing 100021，China）

Objective To establish calcitonin gene-related peptideα（CGRPα）andβ（CGRPβ）transgenicmice and analyze dynamic changes of blood pressure using this transgenic mouse model in hypertension research.M ethods The transgenic vector was constructed by inserting the human CGRPαand CGRPβgene into the down steam of chickenβactin promoter，respectively.The transgenic mice were created by microinjection.The genotype of transgenic line was identified by PCR and the expression level of target gene was determined by Western blot.Dynamic changes of blood pressure wasmeasured by noninvasive blood pressure meter.Resu lts One line of human CGRPαC57BL/6J transgenic mice with high levels of CGRPαexpression in the heart，lung，kidney and liver tissueswas established.One line of human CGRPβC57BL/6J transgenic mice with high levels of CGRPβexpression in the lung and liver tissues was established.Mice overexpressing the human CGRPαwere normotensive，whereas mice overexpressing the human CGRPβwere hypotensive at12 months ofage.Conclusions CGRPαand CGRPβtransgenicmicemay serve as an animalmodel for themechanism research on the roles of CGRP on peripheral vascular resistance and hypertension resistance.

CGRP；Transgene；Peripheral vascular resistance；Hypertension resistance

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0011-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.003

国家自然科学基金（31301932）。

鲍丹（1987-），女，本科，心肌病和高血压动物模型的制备与分析。

吕丹（1980-），女，副研究员，心肌病及高血压相关动物模型建立及相关调节基因功能分析。

﹞2015-08-18

研究报告