食酸代尔夫特菌16SrRNA检测及生物学特性研究

陶元勇，徐筱林，贾 微，王保强，孙铭艳，赵乃昕

食酸代尔夫特菌16SrRNA检测及生物学特性研究

陶元勇1，徐筱林2，贾 微3，王保强1，孙铭艳1，赵乃昕3

目的 监测食酸代尔夫特菌的生物学特征、分子生物学特性及其与感染的关系。方法 血标本培养阳性者，革兰染色阴性杆菌、球杆菌，进行形态、培养特征、细胞壁化学成分分析和16SrRNA 基因测序。结果 经形态学、培养特征和16SrRNA 基因测序，鉴定为食酸代尔夫特菌。测定的1 418 bp序列与此种菌的模式株的序列100%一致，分离菌株与模式株的生化反应有一项不同。结论 本文报道食酸代尔夫特菌的53种生物学特性，为常规生化表型鉴定提供借鉴。

肺纤维化；食酸代尔夫特菌；血培养；16SrRNA基因序列

代尔伏特菌属为1999年澳大利亚学者Wen[1]等新建的菌属，并将以前的食酸丛毛单胞菌重新命名为食酸代尔夫特菌。该菌广泛分布于自然环境中，是人类少见的条件致病菌，该菌临床常规鉴定比较困难，故临床报道较少。作者从一肺炎患者的血液和痰液分离出一株革兰阴性杆菌，经VITEK2 Compact上机鉴定为罕见罗尔斯顿菌，但仍有一些生化反应不符，之后经过16SrRNA检测证实为食酸代尔夫特菌。为此对食酸代尔夫特菌进行了生物学研究，且与罗尔斯顿菌属、代尔伏特菌属生化特性进行了比较鉴别，并提出食酸代尔夫特菌的初步表型鉴定思路。结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料：患者徐某，男，83岁，退休干部，2009年11月因肺部感染伴发热住院。既往患肺纤维化20余年、糖尿病10余年病史。无高血压、结核病和过敏史，长期使用类固醇激素，有30余年吸烟史，每天吸烟20～30支。入院前感冒咳嗽，脓痰，并带血丝，发热最高达39.6 ℃，气短，胸闷，胸部不适，畏寒，无盗汗。查体营养良好，意识清醒，略显虚弱。皮肤黏膜无黄染，皮下和黏膜下淋巴结未触及肿大。 实验室检查：RBC 4.21×1012/L，WBC 13.2×109/L，其中N 85.1%，L 11.5%，M 2.7%，E 0.4%，B 0.3%。PLT 264×109/L。PCT(降钙素原)2.0 ng/mL，hs-CRP 102.32 mg/L。诊断为肺炎并血流感染，治疗用左氧氟沙星和头孢他啶治疗，病情迅速好转并退烧，影像检查显示炎症病灶消退。

1.2 细菌培养与鉴定 住院后送检血培养一套(需氧瓶+厌氧瓶)、痰培养2次。血培养瓶上培养仪后27 h报阳，涂片为革兰阴性杆菌，随即一级报告，并转种血平板、巧克力平板、MAC平板，35 ℃孵育18～24 h观察菌落特征并进行涂片染色镜检，氧化酶试验、OF试验。痰培养接种血平板、巧克力平板、MAC平板。选择纯培养菌落Vitek2 Compact上机鉴定使用GNI卡和GNS卡，按照仪器SOP文件进行操作。

1.3 药敏试验 采用KB法、上机MIC法，根据涂片染色镜检以及氧化酶试验、OF试验等结果选择抗菌药物进行试验，并判断结果。

1.4 细菌生理生化特性 常规生理生化试验方法[2-3]，选择丙酸盐、D-丙氨酸、甘氨酸、淀粉、明胶、七叶苷、甘油等物质为细菌反应底物，观察该细菌的生理生化特性，并与罗尔斯顿菌属细菌进行比较。

1.5 细菌DNA的提取与纯化 采用上海生工生物工程技术服务有限公司试剂盒，从平板上直接挑取细菌分离株，按说明书进行操作。

1.6 16SrRNA基因测序 采用文献[4]通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行16SrRNA基因PCR扩增，产物纯化后由上海生工生物工程技术有限公司进行DNA测序。

2 结 果

2.1 痰液标本直接涂片见到细胞内革兰染色阴性杆菌。培养18-24 h菌体细短，有部分菌体稍长，以短杆菌为主，见图1-3。

2.2 血平板上培养24 h后，小菌落，扁平光滑。培养48 h，菌落中等大小，圆形、扁平、灰白色、不溶血。在巧克力平板上菌落与以上相似，在麦康凯琼脂、营养琼脂上不生长。30 ℃可生长，4 ℃不生长，41 ℃不生长，在0.5%～1.5%NaCl蛋白胨水生长，6.5%NaCl蛋白胨水不生长。

2.3 细菌生理生化反应 触酶阳性、氧化酶阳性，不发酵葡萄糖，符合非发酵菌特点。Vitek上机GNI卡鉴定结果：罕见罗尔斯顿菌。

2.4 16SrRNA基因测序结果 登录NCBI网站，该菌的16SrRNA基因序列经BLAST比对，并与GenBank 数据库做相似性分析。结果表明，该菌株与已知的食酸代尔夫特菌(Delftiaacidovorans)的16SrRNA基因相似性达100%，因而该细菌最终鉴定为食酸代尔夫特菌，登录号为NR_024711.1。

2.5 分离菌株与罗尔斯顿菌属细菌的部分常用生化反应比较鉴别，见表1。

2.6 分离菌株与食酸代尔夫特菌生化反应结果比较，见表2。

2.7 药敏试验结果 该菌对亚胺培南、美罗培南、左氧氟沙星、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、环丙沙星敏感，对头孢曲松、头孢噻肟中介，对氨曲南、庆大霉素、氨苄西林、阿米卡星耐药。

图1 痰涂片细菌形态

3 讨 论

从生物系统发育上代尔夫特菌归属于rRNA超科III(rRNA superfamily III)变形菌β亚纲，丛毛单胞菌科。1999年澳大利亚学者Wen等[1]通过对丛毛单胞菌科(Comamonadaceac)的细菌和一些未分类菌株的细菌的16S rRNA基因测序分析，将食酸丛毛单胞菌 (Comamonadaceac acidovorans) 从丛毛单胞菌中移出，建立一个新菌属-代尔夫特菌属(Deiftia)。该属细菌为革兰阴性杆菌，氧化酶和触酶阳性，无芽孢，不产生荧光色素，细胞内积有聚β-羟丁酸盐[6]，并将食酸丛毛菌命名为食酸代尔夫特菌(D. acidovorans)。食酸代尔夫特菌模式株ATCC15668T于1926年分离于荷兰代尔夫特市含有丰富乙酰胺的土壤中[1]，故而得名。该菌广泛存在于自然界中如河水、土壤等，是人类少见的条件致病菌[8]。1976年Weintein报道了该菌引起留置血压监视器医院相关的菌血症，1990年Horowitz[7]等首次报道食酸代尔夫特菌引起心内膜炎。该患者为42岁女性，长期酗酒和10年吸毒史。该菌所致感染国内也有报道，1998年高向远报道1例食酸代尔夫特菌肺炎，2002年张全华等[9]报道1例术后感染所致败血症，2011年季宝建[10]等报道1例84岁女性患者有代尔夫特食酸菌引起肺部感染合并血液感染。食酸代尔夫特菌对氨基糖苷类抗菌药物天然耐药[11]，本株细菌对喹诺酮类、碳青霉烯类以及部分三代头孢菌素等敏感，对头孢曲松和头孢噻肟中介。因此，对临床分离株做准确鉴定和药敏试验是合理应用抗菌药物的基础。食酸代尔夫特菌致病性不强，多引起免疫功能降低者感染，应在治疗基础疾病的同时注意保护患者的免疫功能免受细菌侵染。因此，准确的病原菌诊断对于临床抗菌药物选择具有重要意义。

表1 分离株与罗尔斯顿菌属生化特征的比较

表1(续)

表2 分离株与食酸代尔伏特菌生化反应比较

Tab.2 Comparison of biochemical reactions of isolated strains andD.acidovorans

特征Characteristic分离株isolatedstrain食酸代尔夫特菌D.acidovoransATCC15668TD.tsuruhatensis[5]菌落色素Colonypigment米色无色素氧化酶Oxidase+++硝酸盐还原Nitratereduction+++尿素Urea──+明胶液化Gelatinliquefaction───七叶苷Esculin──Tween80+++DNase──精氨酸双水解Aagininedehydrolase──+淀粉水解Hydrolysisofstarch───触酶试验catalyzation+++西蒙枸橼酸盐Simoncitrate─ND多粘菌素敏感PolymyxinsensitivesND同化试验AssimilationExperi-ment同化葡萄糖Glucoseassimilation───N-乙酰葡萄糖胺N-acetylglucosea-mine──+L-阿拉伯糖L-Arabiasugar───癸酸盐DecanoatewND柠檬酸盐nitratecitrate+ND+苯乙酸盐Phenylacetate++D-葡萄糖酸盐D-glucose+NDDL-乳酸盐DL-lactate++蕈糖Trehalose+ND麦芽糖Maltobiose─ND蔗糖Sucrose──精氨酸Arginine──

表2(续1)

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性；v表示未确定；W表示弱阳性。d：表示11%～89%菌株阳性;v：不同菌株反应可变;ND：无资料;S：敏感.

Note: "+" positive, "-" negative; V not determined; W weakly positive. d: 11%～89% positive; V: different strains of the reaction variable; ND: no data; S: sensitive.

食酸代尔夫特菌不利用葡萄糖、果糖、木糖、麦芽糖等，生理生化特征复杂，表型鉴定困难，本文从血液和痰液中分离的纯菌株，经Vitek自动鉴定为罕见罗尔斯顿菌，但经生化反应复核验证，有硝酸盐还原、尿素、触酶试验等多种重要反应结果不一致。如食酸代尔夫特菌上述三个实验为“+ -+”，而罕见罗尔斯顿菌为“ - + -”，实验菌株非罕见罗尔斯顿菌得可能性仍较大。后经16SrRNA测序证实为食酸代尔夫特菌，并对该菌进行53种的生物学特征研究，其中癸酸盐、D-丙氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、DL-正亮氨酸、3-羟基丁酸盐、2,3-丁二醇、甘氨酸、对羟基苯甲酸盐、正己酸盐等22种生化反应结果未见资料报道，但是本实验株与食酸代尔夫特菌标准菌株ATCC15668T相比，仍有生化反应不一致，如实验株甘露醇为阴性，而标准菌株为阳性；实验株菌落有米黄色色素，而标准菌株不产色素等。可能是由于地域不同环境差异所致。近年来随着国家临床抗菌药物专项整治活动的开展和各医疗机构对细菌耐药性的重视，临床微生物实验室的条件大大改善并相继配备了各种类型的细菌全自动鉴定和药敏系统，可鉴定大部分临床细菌和药敏试验。但由于各型仪器的细菌数据库及细菌生化反应模式的局限性，加上同一个种的细菌生化特征可能存有不同特点，使一部分细菌不能鉴定，而且有些鉴定结果是不正确的。本研究来自血液和痰液的食酸代尔夫特菌经自动仪器鉴定出罕见罗尔斯顿菌，说明实验室工作者需要积累经验，准确辨别。

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The 16SrRNA gene and biological characteristics ofDelftiaacidovorans

TAO Yuan-yong1,XU Xiao-lin2,JIA Wei3,WANG Bao-qiang1,SUN Ming-yan1,ZHAO Nai-xin3

(1.WeifangMedicalUniversityHospital,Weifang261031,China;2.ChangleChineseMedicineHospital,Changle262400,China;3.WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China)

We studied the biological and molecular characteristics ofDelftiaacidovoransand its relationship with infection. Blood samples were cultured positive. By Gram staining, gram negative bacilli and coccobacillus can be observed under microscope. Results showed the morphology, cultural characteristics, 16SrRNA gene sequence, and identification of bacteria forDelftiaacidovorans. Results showed that determination results of 1 418 bp sequence were consistent with this kind of bacteria strain pattern in the sequence of 100%. There was a different biochemical reaction between isolates and type strain. In this paper, we reported the biological properties of 53 types ofDelftiaacidovorans, providing reference for routine identification.

pulmonary fibrosis;Deiftiaacidovorans; blood culture; 16SrRNA gene sequence

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.014

1.潍坊医学院附属医院检验科，潍坊 261031; Email:taoyanyong@163.com 2.昌乐中医院，昌乐 262400; 3.潍坊医学院，潍坊 261053

R378

A

1002-2694(2015)08-0751-06

2014-12-29；

2015-03-17