25个南瓜品种不同溶剂提取物抗氧化活性研究

王士苗,康文艺,孙 丽,周俊国,李新峥,*

(1.河南科技学院园艺园林学院,河南新乡 453003;2.河南大学药学院,河南开封 475000)

25个南瓜品种不同溶剂提取物抗氧化活性研究

王士苗1,康文艺2,孙 丽1,周俊国1,李新峥1,*

(1.河南科技学院园艺园林学院,河南新乡 453003;2.河南大学药学院,河南开封 475000)

采用清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、清除[2,2′-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐](ABTS)自由基以及铁离子还原能力(FRAP)的方法,以BHT为阳性对照药物,研究25个南瓜品种的体外抗氧化活性。结果表明:南瓜提取物清除DPPH自由基能力均较弱;“汕美2号”乙酸乙酯清除ABTS自由基(IC50=(4.41±0.23)μg/mL)能力最强,强于阳性对照BHT(IC50=(8.59±0.56)μg/mL);对于还原Fe3+能力,乙酸乙酯提取物高于其他部位提取物,其中“改良蜜本”乙酸乙酯部位(TEAC=(529.65±69.52)μmol/g)的还原能力弱于阳性对照Trolox(TEAC=(1387.51±37.93)μmol/g)。

南瓜果实,体外抗氧化,DPPH,ABTS,FRAP

正常机体中自由基氧化作用与抗氧化防御作用处于动态平衡中,但在自由基产生过多或抗氧化防御系统作用减弱时,体内自由基则不能被完全清除而累积进而损害机体,导致一系列相关疾病,抗氧化剂可以抑制自由基的产生或直接清除自由基。目前食品和医学领域应用的人工合成抗氧化剂如BHT、BHA等有诸多副作用。因此,近年来从自然界中寻求天然、安全抗氧化剂已引起研究人员的高度重视。

表1 南瓜序号与品种、类型、来源

关于南瓜的研究多集中于水溶性多糖成分上,且实验用所南瓜材料大都是随机选取,且只选择某个品种或少量几个品种[14-17],本实验对25种中国南瓜和日本南瓜品种石油醚、乙酸乙酯、甲醇提取物抗氧化能力进行综合考察,具有品种广泛性和代表性,以期为南瓜抗氧化活性研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南瓜 为河南科技学院南瓜实验基地种植的25个南瓜品种及组合,包括中国南瓜(CucurbitamoschtaDuch.)和印度南瓜(CucurbitamaximaDuch.),详见表1。2013年3月30日浸种催芽,4月3日播种育苗,4月15日定植。采用随机区组设计,每个品种设3次重复,共15个小区,每个小区种3畦,每畦种植2行。采样时从每个小区中选取3个成熟度一致具有该品种代表性状的果实,在生育期采用常规的栽培管理措施,于2013年7～8月间取材,并经过后熟和贮藏,在9～10月份进行测定分析。

二苯代苦味酰基自由基(DPPH) 东京化成工业株式会社;ABTS 德国Fluka公司;6-三吡啶基三嗪(TPTZ)及二丁基羟基甲苯(BHT) 均购自比利时Across Organics公司;Trolox(6-hydroloxy-2,5,7,8-tetram-ethylchroman-2-carboxylicaci) 美国Sigma-Aldrich公司;其余试剂均为分析纯。

Multiskan MK3型酶标仪 美国Thermo Electron公司;电子天平 美国Mettler-Toledo公司;N-1100型旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 提取物样品的制备 南瓜果实洗净去瓤去籽,阴干粉碎后依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇依次加热提取各两次,温度以溶液微沸为宜,每次1h,过滤合并滤液,真空浓缩后分别得到石油醚提取物(PE)、乙酸乙酯提取物(EA)、甲醇提取物(ME)三个部位提取物。

1.2.2 提取物体外抗氧化活性筛选方法

1.2.2.1 清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基法 各提取物用甲醇溶液溶解,配制2.0mg/mL的样品溶液,并参照文献[18]的方法配制200μmol/L的DPPH溶液。在96微孔板中加入10μL样品溶液和175μL DPPH溶液,混合均匀,室温条件下暗反应20min后于515nm下测定其吸光值。每份样品平行测定3次,求均值并按照下式计算样品清除率。样品溶液对DPPH自由基清除率高于50%的样品依次往下稀释四个浓度,并依次计算清除率。

清除率(%)=[(A对照-A样品)/A对照]×100

式中,A对照为DPPH本身在测定波长处的A值;A样品为样品溶液对DPPH自由基作用后的A值(除去样品自身吸收)。

计算得到的清除率,运用Origin7.5软件处理,得到样品清除DPPH自由基的半数清除浓度(IC50)。

1.2.2.2 清除[2,2′-联氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二氨盐](ABTS)自由基法 参照[19]方法配制ABTS工作液,96微孔板中加入10μL样品溶液和200μL工作液,混合均匀,室温下暗反应20min,在405nm处测定吸光值,10μL甲醇为对照。每份样品平行重复3次,计算均值。样品清除率按下式计算。初筛活性高于50%样品依次往下稀释四个浓度,并依次计算清除率。

清除率(%)=[(A对照-A样品)/A对照]×100

式中,A对照为ABTS本身在测定波长处的A值;A样品为样品溶液对ABTS自由基作用后的A值(除去样品自身吸收)。

根据计算得到的清除率,运用Origin 7.5软件处理,计算样品清除ABTS自由基的半数清除浓度(IC50)。

1.2.2.3 铁离子还原法/抗氧化总能力测定法(FRAP法) 参照文献[20]的方法配制TPTZ工作液:0.3mol/L醋酸钠缓冲液、10mmol/L TPTZ溶液、20mmol/L FeCl3·6H2O三者体积比为10∶1∶1。首先绘制标准曲线,在96孔板中加入10μLTrolx溶液和200μLFRAP工作液,混合均匀,37℃条件下反应30min后在593nm处测定吸光度,分别以标准品Trolx浓度和吸光值为横纵坐标绘制标准曲线。

测定样品时在96孔板中加入10μL样品溶液和配制好的200μL FRAP工作液,每份样品重复3次,计算均值,结果以抗氧化当量(即每克样品的自由基清除能力相当于Trolox的自由基清除能力的微摩尔数TEAC)表示。

2 结果与分析

2.1 样品对DPPH自由基的清除能力

南瓜不同溶剂提取物在初筛浓度为108.11μg/mL时,对DPPH自由基的清除率均小于50%。与阳性对照BHT(浓度为54.05μg/mL时清除率为60.12%)相比,各南瓜品种的提取物清除DPPH自由基的能力均较低。证明南瓜各部位提取物并无清除DPPH自由基的能力。(因为各样品对DPPH自由基清除率均小于50%,无法计算其IC50,对DPPH自由基清除能力较弱,因此不再列表显示。)

2.2 样品对ABTS自由基的清除能力

南瓜提取物在初筛浓度95.24μg/mL时,多个南瓜品种乙酸乙酯部位提取物对ABTS自由基均有清除能力,表2列出了清除能力较好的几个南瓜品种及部位和对应清除率。南瓜提取物中有清除ABTS自由基能力较好的大部分为乙酸乙酯提取部位,其中汕美2号南瓜EA(IC50=(4.41±0.23)μg/mL)、浙江七叶南瓜EA(IC50=(5.36±0.85)μg/mL)、改良蜜本南瓜EA(IC50=(7.78±0.61)μg/mL)抗氧化能力较好,且强于阳性对照BHT(IC50=(8.59±0.56)μg/mL)。

图1列举了清除ABTS自由基能力较好的7个品种。由图1可看出,在实验浓度范围内,随着浓度升高,南瓜提取物对ABTS自由基清除率也逐渐升高。在浓度小于23.81μg/mL时,乙酸乙酯部位提取物对ABTS自由基清除率增长较快,超出这个范围后,随浓度升高,对ABTS自由基的清除率升高速度渐缓,至浓度大于47.62μg/mL后,随浓度升高,样品对ABTS自由基清除率不再变化,趋于稳定。

图1 不同品种南瓜提取物对ABTS自由基清除能力Fig.1 The extracts of different varieties pumpkins’ capacity in clear ABTS free radical ability

2.3 铁离子还原能力/总抗氧化能力

表2列出了各提取物中铁离子还原能力较高的几个样品及部位和对应的抗氧化当量值。由表可看出,南瓜提取物的Fe3+还原能力大小依次为:改良蜜本南瓜EA>汕美2号南瓜 EA>早熟京红栗EA>百蜜2号EA>榛盆南瓜EA>九江轿顶南EA>靖边南瓜EA,但它们的抗氧化能力都远小于阳性对照Trolox(TEAC=(1387.51±137.93)μmol/g)。其中改良蜜本(TEAC=(529.65±69.52)μmol/g)、汕美2号(TEAC=(415.26±8.38)μmol/g)和早熟京红栗(TEAC=(401.03±27.36)μmol/g)3个南瓜品种提取物的总抗氧化能力在25个南瓜品种中最高。

表2 不同品种南瓜提取物清除ABTS自由基的能力和TEAC值

3 结论与讨论

目前测定体外抗氧化活性的方法较多,但大多是针对某一种自由基的清除活性,某一个方法的结果通常只代表样品对某个自由基的清除能力。本实验采用三种方法来衡量样品的抗氧化活性。

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基,在517nm附近有较强的吸收,当自由基清除剂加入到DPPH溶液中时,DPPH的单电子被配对,在最大吸收波长处吸收颜色变浅,吸光值也有改变。ABTS是一种水溶性的自由基引发剂,经活性氧氧化后生成一种稳定的蓝绿色阳离子自由基,若待测物中含有抗氧化物,则会与ABTS自由基发生发应而使反应体系颜色褪去。由Bnezie和Starni建立的FRAP法主要衡量样品对Fe3+的还原能力,它反映的不是针对一种自由基的清除活性,而是样品总的还原能力,DPPH和ABTS法均可通过在特定波长下吸光度的变化来评价自由基的清除情况,从而评价实验样品的抗氧化能力,抗氧化能力用清除率表示,清除率越大,抗氧化性越大,FRAP法测定结果抗氧化当量值可用于反映样品总的抗氧化活性。

由结果看出,不同栽培品种南瓜的抗氧化活性不同,不同溶剂提取物之间的抗氧化性也有很大区别,本文采用的3种方法中,南瓜的3种不同溶剂提取物对DPPH自由基的抑制率力均较低,证明南瓜提取物还原DPPH自由基能力较差;ABTS法和FRAP法中,南瓜提取物初筛清除率大50%的样品大部分都是乙酸乙酯(EA)部位提取物,证明南瓜的中等偏低极性成分对ABTS自由基有较好的清除能力,且总还原能力较强。

本实验选取了的25种南瓜品种,主要包括了22种中国南瓜地方品种和3种日本南瓜,具有一定的广泛性和代表性,其中改良蜜本南瓜、汕美2号南瓜提取物清除ABTS自由基能力和Fe3+还原能力高于其他品种,可结合其来源和品种进一步加以深入研究。

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Antioxidant activity of different solvent extracts from 25 kinds of cultivatedCucurbitaLinn. fruitsinvitro

WANG Shi-miao1,KANG Wen-yi2,SUN Li1,ZHOU Jun-guo1,LI Xin-zheng1,*

(1.School of Horticulture and Landscape Architecture,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China;2. School of Pharmacy,Henan University College,Kaifeng 475000,China)

This study was aimed to evaluate the antioxidant activity of 25 kinds of pumpkin extractioninvitro. The scavenging of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radicals and(2,2′-even the ammonia(3-ethyl benzene and thiazole-6-sulfonic acid)diamonium salt)(ABTS)radicals assay and ferric reducing capacity(FRAP)assay were used to measure the antioxidant activity of pumpkins. And BHT was used as the positive control drug. Results showed that the scavenging capability of DPPH free radical ability was weak. The ethyl acetate extract of Shanmei II showed the strongest power to clear ABTS radical(IC50=(4.41±0.23)μg/mL),better than that of BHT(IC50=(8.59±0.56)μg/mL). The power of ethyl acetate for reduction of Fe3+ability was higher than that of other extracts,and Gailiangmiben ethyl acetate extract(TEAC=(529.65±69.52)μmol/g)was weaker than that of Trolox(TEAC=(1387.51±37.93)μmol/g).

pumpkin fruit;antioxidantinvitro;DPPH;ABTS;FRAP

2014-05-19

王士苗(1989-),女,在读硕士生,研究方向:蔬菜种质资源研究与利用。

*通讯作者:李新峥(1965-),男,学士，教授,主要从事南瓜资源特性与开发利用研究。

河南省高校科技创新团队支持计划(2012IRTSTHN016)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)07-0118-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.016