不同室温下EDTA修复时间对P504S蛋白在前列腺癌组织中表达的影响研究

禤瑞霞

不同室温下EDTA修复时间对P504S蛋白在前列腺癌组织中表达的影响研究

禤瑞霞

目的 探讨不同室温下EDTA修复时间对P504S蛋白在前列腺癌组织中表达的影响情况。方法 分析30例前列腺癌患者临床资料, 将病理标本分别在3种不同室温下进行抗原修复, 分别每例标本切9张片。观察不同室温下进行抗原修复显色反应和背景显色情况。结果 室温8～10℃抗原修复30 min, 室温18～20℃抗原修复20、25 min显色反应的准确率最高, 背景显色效果最好, P＜0.05, 差异均有统计学意义。结论 室温8～10℃抗原修复30 min, 18～20℃抗原修复20、25 min对P504S蛋白在前列腺癌组织中表达显色效果最好, 为病理诊断提供准确依据, 值得临床推广应用。

不同室温；EDTA修复时间；P504S蛋白；前列腺癌；表达；影响

前列腺癌属于典型老年性疾病, 据美国癌症协会统计, 70%以上的前列腺癌患者年龄＞65岁, 其中60～79岁的发病率达0.17%, 我国发病年龄亦然［1］。目前, 已公认前列腺癌的发病与高脂肪饮食有关, 导致前列腺癌危险因素和保护因素的失衡, 在低危人群出现发病率明显增高趋势, 而且由于前列腺癌进展缓慢, 致病因素的刺激往往在数十年后才能表现为发病率的增高, 在我国的发病率也存在上升趋势［2］。本研究通过3种不同室内温度及3种不同的抗原修复时间对30例前列腺癌组织标本进行修复检测比较, 探寻出适合广东地区的最佳抗原修复时间, 现将研究结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取广东省中山市中医院病理科2012年3月～2014年5月收治的前列腺癌患者30例临床资料进行分析,选取患者的存档蜡块标本进行观察, 其中手术切除标本16例, 经尿道电切标本10例, 穿刺活检标本4例。将病理标本分别在3种不同室温(8～10℃、18～20℃、28～30℃)下进行抗原修复, 分别每例标本切9张片。将每例的9张切片分为九组, 在相同室温下分别进行20、25、30 min的抗原修复。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂 ①选择福州迈新生物技术开发有限公司的产品：EDTA抗原修复液(pH=9.0)、兔抗人α-甲酰基辅酶A消旋酶(P504S)、快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物、DAB缓冲液、DAB底物、DAB色原、PBS磷酸盐缓冲液。②上海宏兹实业有限公司生产的环保透明剂、广东汕头西陇化工有限公司生产的酒精。

1.2.2 方法 石蜡组织切片脱蜡至水, 并浸泡于水中待用,取适量已稀释成工作液的EDTA抗原修复液(按1：50比例)于高压锅中, 将高压锅置于电磁炉上, 大功率加热至沸腾后将功率调至最小, 将置于耐高温架上的切片放进已沸腾的修复液中, 盖上锅盖, 继续加热至喷气1 min后将不锈钢锅离开电磁炉, 并用流水在高压锅外壁分别冲冼20、25、30 min (时间均从切片放进修复液中计起), 冷却至室温后取出切片,流水冲洗3 min, 在离组织3 mm处用油笔画圈后用PBS冲冼3次, 3 min/次, 滴加新鲜配制DAB显色液100 μl, 室温下染色3 min, 自来水冲洗, 苏木素复染, 自来水冲洗10 min返蓝,再经酒精梯度脱水, CR3透明, 中性树胶封固, 镜下观察阳性细胞数量及染色强度, 并进行对比、分析、记录。

1.3 结果判定标准 以胞浆内出现棕黄色或者棕色颗粒表示阳性, 阴性表示为(-)、弱阳性表示为(+)、阳性表示为(++)。背景清晰表示为(-)、轻微的背景染色表示为(+)。

1.4 观察指标 观察在室温8～10℃抗原修复20、25、30 min, 室温18～20℃抗原修复20、25、30 min, 室温28～30℃抗原修复20、25、30 min显色反应和背景显色情况。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

不同室温下EDTA修复时间下P504S蛋白在前列腺癌组织中表达情况：室温8～10℃抗原修复30 min, 室温18～20℃抗原修复20、25 min显色反应的准确率最高, 背景显色效果最好, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 不同室温下EDTA修复时间下P504S蛋白在前列腺癌组织中表达情况(n)

3 讨论

前列腺癌(PCa)是男性泌尿生殖系肿瘤中最为常见的一种, 属于人类特有的疾病［3］。有资料显示［4］, 在欧美前列腺癌死亡比例较高, 在北欧国家前列腺癌的发病率占男性肿瘤的首位, 在美国是男性癌症死亡率的第二位, 仅低于肺癌。前列腺癌临床诊断依据主要是肿瘤细胞的特异性、组织结构和浸润方式等, 一些前列腺癌往往在光镜下不容易找到充足的诊断依据, 进行确诊时相对困难, 尤其是一些穿刺活检方式, 往往有一定的局限性, 进而提高了病理学诊断的要求,选择高敏感性的免疫组化方式进行前列腺癌的确诊具有重要的意义［5］。组织病理学组织通过甲醛固定, 在固定的过程中会形成醛键及羟甲基, 对抗原决定簇进行封闭, 甲醛和蛋白质发生交联, 从而形成醛交联蛋白, 对抗原进行封闭, 促使抗原无法表达［6］。在通过甲醛进行固定的过程中, 要通过酶消化或者热抗原修复的方法来对蛋白和甲醛交联化合物-醛键进行割裂, 从而将抗原决定簇充分的暴露, 促进其染色［7］。抗原修复的过程是石蜡切片免疫组化染色前用酶、表面活性剂、微波、金属盐等对抗原决定簇进行暴露和修复, 从而促使抗原充分的暴露, 进而抗原在一定程度上得到恢复, 抗原热修复是一个免疫组化的重要步骤, 有可能由于不同条件引起阳性细胞和染色强度发生变化, 直接对染色结果和组织病理学的判定造成重大的影响［8］。P504S属于前列腺癌的特异性标记物, P504S蛋白多存在于过氧化物酶和线粒体上面,其属于α甲酰基辅酶A消旋。P504S只是在前列腺癌和一些高级别皮内肿瘤中呈现强阳性表达, 但是在前列腺的良性肿瘤中表达较少。有资料显示P504S表达和不同的Gleason分级具有明显的差异性和等级的相关性, 因而P504S表达对于前列腺癌恶性程度评价具有重要的意义。P504S在前列腺肿瘤的诊断与鉴别诊断中发挥着越来越重要的作用, 另外由于室温因环境变化可能有一定的改变, 对于不同室温下EDTA修复时间, P504S蛋白表达是否存在一定的影响, 目前研究结果较少。

综上所述, 室温8～10℃抗原修复30 min, 18～20℃抗原修复20、25 min对P504S蛋白在前列腺癌组织中表达显色效果最好, 可提高P504S在前列腺癌组织中着色强度及阳性表达率, 为病理诊断提供准确依据, 值得临床推广应用。

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Research of influence of EDTA repair time in different indoor temperature on expression of P504S protein in prostatic cancer tissue

XUAN Rui-xia.Guangdong Zhongshan City Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhongshan 528400, China

Objective To investigate influence of EDTA repair time in different indoor temperature on expression of P504S protein in prostatic cancer tissue.Methods Clinical data of 30 patients with prostatic cancer were analyzed.Their pathological samples were placed in 3 different indoor temperatures for antigen retrieval, and each sample was made into 9 slices.Chromogenic reaction and background chromogenic condition of antigen retrieval in different indoor temperature were observed.Results The accuracy of chromogenic reaction and effect of background chromogenic condition were in the best situation at 30 min of antigen retrieval in 8～10℃, and at 20 and 25 min in 18～20℃.P＜0.05, The difference had statistical significance.Conclusion Antigen retrieval in 8～10℃ for 30 min and 18～20℃ for 20 and 25 min have the best effect for expression of P504S portion in prostatic cancer tissue, and that can provide accurate reference for pathological diagnosis.It is worthy of clinical promotion and application.

Different indoor temperature; EDTA repair time; P504S protein; Prostatic cancer; Expression; Influence

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.09.007

2014-11-17］

528400 广东省中山市中医院