pH与微乳辅料对白藜芦醇稳定性影响的研究

姚 倩,颜 军,何 钢,梁 立,代田洋,曾 聪,苟小军

(成都大学药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室,四川成都 610106)

pH与微乳辅料对白藜芦醇稳定性影响的研究

姚 倩,颜 军,何 钢,梁 立,代田洋,曾 聪,苟小军*

(成都大学药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室,四川成都 610106)

本研究考察pH和微乳处方中的辅料对白藜芦醇稳定性的影响。首先制备含等量白藜芦醇、pH不同的溶液,再分别将油相、乳化剂及助溶剂与白藜芦醇单独配伍或辅料混合后配伍,制成混合溶液,在40 ℃下放置不同时间,定时取样测定。分别对浓度-时间曲线按各级动力学方程进行回归,由降解速率常数推断pH及各辅料对白藜芦醇稳定性的影响。结果表明,白藜芦醇溶液稳定的pH范围为3.6～5.0;微乳各辅料单独与白藜芦醇配伍均加速了白藜芦醇的降解,但辅料混合后再与成分配伍其降解减慢,甚至可改善白藜芦醇的稳定性。制备白藜芦醇微乳适合选择聚氧乙烯蓖麻油为乳化剂,聚乙二醇400为助溶剂。

白藜芦醇微乳,pH,辅料,稳定性

白藜芦醇广泛存在于自然界中,在日用食物如葡萄、花生及常见的植物如虎杖、藜芦及决明中均含有白藜芦醇[1]。大量的研究发现白藜芦醇具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌、调节血脂等作用[2-3],使得白藜芦醇相关保健食品的开发成为研究的一大热点。然而因白藜芦醇水溶性较差,溶解成为制约其吸收,继而影响其功效发挥的一重要因素[4-5]。微乳是由油、水、表面活性剂与助溶剂形成的热力学稳定的一分散体系,由于表面活性剂与助溶剂的存在,微乳能增加难溶成分的溶解度,并具有靶向释放、提高疗效与降低毒副作用等功效[6-8]。如盐酸黄连素制成纳米微乳后对大肠杆菌、沙门氏菌等多种细菌的抗菌活性明显高于传统片剂、胶囊剂和水溶液[8];紫杉醇-五味子乙素微乳显著降低了紫杉醇的毒性,同时提高了紫杉醇的抗肿瘤作用[9]。基于微乳在增效与改善口服吸收方面的独特优势,本课题组分别以棕榈酸异丙酯为油相,吐温-80(Tween-80)、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL,EL)为乳化剂,聚乙二醇300(polyethylene glycol 300,PEG300)、聚乙二醇400(polyethylene glycol 400,PEG400)为助溶剂,制备了白藜芦醇微乳,以期提高白藜芦醇口服生物利用度与疗效。此项研究主要采用动力学原理探讨溶液pH及微乳处方辅料对白藜芦醇稳定性的影响,为微乳处方工艺的优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白藜芦醇 西安天一生物制品有限公司,纯度大于99.0%;EL Sigma公司;PEG300、PEG400 国药集团化学试剂厂;棕榈酸异丙酯 Labcaster公司;吐温-80 成都市科龙化工试剂厂;HPLC仪用水为超纯水,其余试剂均为分析纯。

表1 白藜芦醇与不同辅料配伍方案

P680型高效液相色谱仪、TCC-100型柱温箱、PDA-100型二极管阵列检测器 美国戴安公司;DNP-9025型电热恒温培养箱 扬州洪都电子有限公司;KQ-3200型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白藜芦醇微乳处方 处方中油、表面活性剂、助溶剂及水的比例为2∶1∶1∶6(v/v/v/v),其中1 mL微乳中含白藜芦醇0.1 mg。

1.2.2 色谱条件 色谱柱:迪马C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-0.1 mol·L-1乙酸(40∶60);流速:1 mL·min-1;检测波长:306 nm;柱温:35 ℃;进样量:20 μL。

1.2.3 空白干扰实验 取棕榈酸异丙酯(oil)、EL、Tween-80、PEG300及PEG400的混合物(2∶1∶1∶1∶1,v/v/v/v)15 mL,置25 mL量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀;精密量取20 μL,注入液相色谱仪,考察各辅料对测定有无干扰。

1.2.4 线性关系 取白藜芦醇对照品10.5 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得白藜芦醇对照品贮备液。精密量取上述贮备液0.5,1,2,3,4,5 mL,分别置10 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀。照“色谱条件”项下的方法分别取上述溶液20 μL注入液相色谱仪,记录色谱图,以主峰面积A对白藜芦醇浓度C(μg·mL-1)回归。

1.2.5 回收率 取3个25 mL量瓶,分别加入浓度为1 mg/mL的白藜芦醇贮备液0.2、0.25、0.3 mL,另分别加入棕榈酸异丙酯、EL、Tween-80、PEG300及PEG400的混合物(2∶1∶1∶1∶1,v/v/v/v)15 mL,用去离子水稀释至刻度,摇匀;精密量取20 μL,注入HPLC仪,测定白藜芦醇含量,以加入量作比较,计算回收率;每个浓度重复操作3次。

1.2.6 精密度 分别配制浓度为40 μg/mL的白藜芦醇溶液,以及含各辅料、白藜芦醇浓度为10 μg/mL的溶液各6份,用HPLC仪测定含量,以峰面积值计算RSD,考察方法的精密度。

1.2.7 pH对白藜芦醇稳定性的影响 根据《中国药典》一部2010版附录XVD[10],使用醋酸-醋酸钠,氨-氯化铵缓冲系统,配制pH分别为1.0,2.3,3.6,5.0,6.0,7.4,8.0和9.2等8个缓冲溶液,配制过程确保在各缓冲溶液中加入相同摩尔数的盐,使得各缓冲系统有近似的离子强度。取8个25 mL量瓶,精密加入浓度为1 mg/mL的白藜芦醇溶液1 mL,用不同pH的缓冲溶液稀释至刻度,摇匀。将各量瓶的瓶口用封口胶密封后,置40 ℃下分别放置不同时间后,精密量取20 μL,注入液相色谱仪,测定白藜芦醇含量;采样时间120 h,前8 h取5个时间点检测,之后每日测定一次,当90%以上样品中所含白藜芦醇已降解一半时,停止采样。分别按零级动力学方程C=C0-kt,一级动力学方程lgC=lgC0-kt/2.303,及二级动力学方程1/C=1/C0+kt,对C-t数据进行线性回归。

1.2.8 微乳处方对白藜芦醇稳定性的影响 称取白藜芦醇原料25.3 mg,置25 mL量瓶中,用无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为贮备液。另取9个25 mL量瓶,编号,分别按表1依次加入各成分后,用去离子水稀释至刻度,摇匀,瓶口用封口胶密封。将9份样品置40 ℃恒温箱中,分别于不同时间点,精密量取20 μL,用HPLC仪测定白藜芦醇含量;采样时间100 h,前24 h设定5个时间点检测,之后每日测定一次,当观察到90%以上样品中所含白藜芦醇已降解50%时,结束测定。以时间为自变量,药物浓度为函数,分别按零级、一级及二级动力学方程,对C-t数据进行线性回归,考察白藜芦醇与不同处方配伍的降解动力学。

1.2.9 数据处理 所有数据为3次以上实验的平均值;采用Excel 2010版软件对数据进行拟合。

2 结果与分析

2.1 空白干扰与线性关系

色谱图(图1)显示,白藜芦醇保留时间为4.26 min,在白藜芦醇出峰处各辅料对测定无干扰。峰面积 A 对白藜芦醇浓度 C(μg·mL-1)回归方程为A=3.289×103+5.743×104C,r=0.9999,表明白藜芦醇在5～50 μg·mL-1浓度范围内,线性关系良好。

图1 空白辅料与白藜芦醇的HPLC图Fig.1 HPLC chromatographs of excipients and resveratrol

2.2 回收率与精密度

白藜芦醇与混合辅料制成的高、中、低浓度溶液回收率分别为98.32%±0.45%,97.58%±0.61%,97.23%±1.17%,表明方法有较好的准确度;40、10 μg/mL白藜芦醇溶液HPLC测得值的RSD分别为0.81%及1.32%,方法精密度良好。

2.3 pH对白藜芦醇稳定性的影响

白藜芦醇在不同pH溶液中的降解过程符合二级动力学方程(表2)。将回归所得速率常数k取对数后,以pH为横坐标,lgk为纵坐标绘制曲线(图2),拟合得到的方程为lgk=0.5961-0.6772pH+0.08566pH2(r=0.9943)。由方程和图2可知,白藜芦醇溶液最稳定的pH范围为3.6～5.0。

表2 白藜芦醇在不同pH溶液中的二级降解动力学过程

图2 lgk-pH曲线Fig.2 Curve of lgk versus pH

制备的微乳pH环境多在6左右,基于白藜芦醇的pH稳定性,曾考虑加入乙酸降低微乳pH,然而在酸性下微乳成型性不佳,易发生团聚,因此微乳制备中取消了pH调节这一步,白藜芦醇最后分散在pH6.0～6.5的近中性微乳溶液中。

2.4 微乳处方对白藜芦醇稳定性的影响

对白藜芦醇与微乳不同辅料混合后的降解动力学过程进行了拟合,结果显示,一级与二级动力学方程的拟合优度较佳(r>0.90),而一级动力学的拟合效果为最好(r>0.95)(表3,表4)。由表可知,微乳处方中的辅料均对白藜芦醇稳定性产生了较大的影响,油、吐温-80、EL及PEG300引起白藜芦醇降解速率分别增大11、12.5、8.5及15倍;仅PEG400影响相对较小,配伍后白藜芦醇降解速率增加了约60%。白藜芦醇在PEG400中的稳定性显著优于PEG300,可能的原因为PEG300的引入增加了组分的溶解度[11],同时也增强了其与水之间的相互作用,导致降解加快;PEG400不仅可改善组分的水溶性,还能降低活性成分所处环境的极性,有助于提高成分的稳定性[12]。乳化剂EL对白藜芦醇稳定性的不良影响小于吐温-80(表3)。

虽然微乳处方各辅料单独与白藜芦醇配伍极大地促进了组分的降解,但若预先将各辅料混合后再配伍,白藜芦醇的降解则开始减慢,如PEG300与油、乳化剂的混合物使组分降解速率增大7倍,较单独配伍时的降解速率有了大幅度的减小;PEG400与油、EL合用甚至提高了组分的稳定性,白藜芦醇降解速率仅为原组分的86%。可能的原因为根据微乳缓释的特性可判断[13],白藜芦醇被包裹在乳滴内,减少了组分与水之间的接触;另一种可能是某些辅料本身可引起白藜芦醇降解,当它与其他辅料混合时,辅料之间也将产生相互作用,如PEG400的羟基与EL结构中的氧原子能形成氢键结合;油、表面活性剂与助溶剂的疏水基团间可发生疏水键的融合,这些相互作用均可以削弱它们与组分之间的连接,因而对组分的不良影响减弱。

在油相选择方面,除棕榈酸异丙酯外,另考察了菜籽油和花生油,后二者因很难制备出质量稳定的微乳而未选用。在不同pH下的降解实验中,设置的白藜芦醇初始浓度约为40 μg·mL-1,初浓度设置较高,目的是保证能在较长的时间内观察活性成分的含量变化;而在研究辅料对组分稳定性的影响时,选择的白藜芦醇浓度为10 μg·mL-1,这主要考虑到口服微乳在体内将被体液稀释,而注射用微乳在使用前通常会用生理盐水或葡萄糖溶液稀释,白藜芦醇的实际使用浓度约为10 μg·mL-1。

表3 一级动力学方程拟合结果

注:C单位μg/mL;RES为白藜芦醇，表4同。

表4 二级动力学拟合结果

3 结论

白藜芦醇在不同pH环境及微乳辅料溶液中的降解过程分别符合二级及一级降解动力学方程,其稳定的pH范围为3.6～5.0。从稳定性方面考察,白藜芦醇微乳助溶剂及乳化剂应分别选择PEG400与EL。虽然微乳处方各辅料单独与白藜芦醇配伍均可加快白藜芦醇的降解,但若预先将各辅料混合后再配伍则组分降解减慢,PEG400、棕榈酸异丙酯与EL的混合物甚至提高了白藜芦醇的稳定性。

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Effect of pH and microemulsion excipients on the stability of resveratrol

YAO Qian,YAN Jun,HE Gang,LIANG Li,DAI Tian-yang,ZENG Cong,GOU Xiao-jun*

(Key Laboratory of Medicinal and Edible Plant Resources Development of Sichuan Education Department,Chengdu University,Chengdu 610106,China)

In this study,the effect of pH and microemulsion excipients on the stability of resveratrol were examined. First,solutions containing equivalent resveratrol with various pH were prepared. Then resveratrol-excipient solutions were formulated,in which resveratrol was either mixed with oil phase,emulsifier,and co-solvent,separately,or blended with them together. The test solutions were placed under 40 ℃ and assayed at specific intervals. Curves of concentration versus time were fitted by sorts of dynamic equations,respectively,from which constants of degradation rate were calculated. The results showed that stable pH range of resveratrol was 3.6 to 5.0. Though microemulsion excipients accelerated degradation of resveratrol when they were mingled with the ingredient separately,the mixture could make resveratrol decomposition slower. Some excipient mixture even improved resveratrol stability. The appropriate emulsifier and co-solvent for resveratrol microemusion were cremophor EL and polyethylene glycol 400,respectively.

resveratrol microemulsion;pH;excipients;stability

2015-01-28

姚倩(1971-),女,博士,教授,研究方向:药食同源植物有效部位的筛选与产品开发,E-mail:yaoqiancd@hotmail.com。

*通讯作者:苟小军(1974-)，男，博士，教授，研究方向：食品化学，E-mail:cddxzyhx@hotmail.com。

教育部留学回国人员科研启动基金(20131792)。

TS202.3

A

1002-0306(2015)21-0098-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.011