固定化蚯蚓纤溶酶热稳定性及热失活动力学研究

雷敬玲,赵钟兴,王朝阳,朱长姐,冯丽锦,卢强基

(广西大学化学化工学院,广西高校资源化工应用新技术重点实验室,广西理工科学实验中心,广西南宁 530004)

固定化蚯蚓纤溶酶热稳定性及热失活动力学研究

雷敬玲,赵钟兴*,王朝阳,朱长姐,冯丽锦,卢强基

(广西大学化学化工学院,广西高校资源化工应用新技术重点实验室,广西理工科学实验中心,广西南宁 530004)

通过纤维蛋白平板法测定蚯蚓纤溶酶在不同温度下的酶活力,对固定化和游离蚯蚓纤溶酶的热失活动力学进行初步分析。实验表明:随温度升高固定化和游离蚯蚓纤溶酶活性减小趋势逐渐增大,酶失活速率加快。当温度超过60 ℃时,两者失活现象明显,但固定化蚯蚓纤溶酶的热稳定性明显优于游离酶。动力学分析表明,在30～60 ℃范围内,固定化和游离蚯蚓纤溶酶热失活的表观活化能分别为130.43 kJ·mol-1和116.65 kJ·mol-1。

蚯蚓纤溶酶,固定化酶,热稳定性,动力学

蚯蚓又称地龙,性寒,味微咸,在医学上用途广泛,具有清热平肝、利尿、解痉、通经、活血化瘀等作用,主治热病惊狂喘咳、急慢惊风,半身不遂、小便不通等,是我国重要的中药材之一[1]。1991年日本学者原恒教授从蚯蚓体内提取到蚯蚓纤溶酶(Earthworm Fibrinolytic Enzyme,EFEs)[2],又名蚓激酶,该酶既具有纤溶酶活性和纤溶酶原激活活性,又能溶解陈旧血栓和抑制新血栓形成,有抗凝溶血栓[3-4]、抗炎[5]、抗癌抗肿瘤[6-8]、降血脂[9]等作用,已有蚓激酶胶囊、蚓激酶肠溶片、溶栓胶囊等药物投入市场。目前国内外许多研究学者已从药理学[10]、组分纯化[11]、酶学性质[12]、生化性质[13]、抗原性[14]、结构和克隆表达[15-17]等方面对蚯蚓纤溶酶进行研究,但是这些研究大都以游离酶为基础,对固定化酶酶动力学的研究鲜有报道。固定化酶操作稳定性好,重复利用率高,本文将蚯蚓纤溶酶固定在实验室自制的磁性壳聚糖微球上,对固定化后的蚯蚓纤溶酶与游离酶进行热失活动力学研究,并计算相关动力学和热力学常数,为固定化蚯蚓纤溶酶的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜蚯蚓(品种为赤子爱胜蚓) 购买于桂林和记低碳农业科技有限公司;尿激酶(酶活500 U·mg-1)、牛凝血酶(2000 U·mg-1) 中国药品检定所;牛纤维蛋白原(蛋白含量65%～85%) 美国SIMGA公司;琼脂糖(凝胶强度(1%)≥750 g r·cm-2) 西班牙GENE公司;共沉淀法制备磁性壳聚糖微球,主要成分为壳聚糖、四氧化三铁;其他药品均为分析纯。

Merlin Compact型扫描电镜 德国卡尔蔡司有限公司;AVATAR360傅里叶变换红外光谱仪 美国尼高力仪器有限公司;Allegra25R台式高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司;510pH计 新加坡热电有限公司;HH-B11型电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 磁性壳聚糖微球的制备及表征

1.2.1.1 磁性壳聚糖微球的制备 将Fe3O4分散于壳聚糖醋酸溶液并加至含有Span-80的液体石蜡中,40 ℃搅拌乳化形成微乳体系,加入戊二醛交联,调节pH至10左右,继续反应1 h,产物洗净,磁铁分离,即可得到磁性壳聚糖微球。

1.2.1.2 磁性壳聚糖微球的表征 采用KBr压片法,将磁性壳聚糖微球在波长4000-1～500 cm-1处进行红外光谱扫描;用Merlin Compact型扫描电镜扫描观测磁性壳聚糖微球的形貌特征。

1.2.2 蚯蚓纤溶酶活性的测定

1.2.2.1 尿激酶标准曲线的制作 采用纤维蛋白平板法[18],5 mL 10 mg·mL-1纤维蛋白原溶液和1 mL 20 U·mL-1凝血酶加入到2%琼脂糖溶液中摇匀,倒入培养皿中室温静置30 min后打孔。每孔进样10 μL,37 ℃培养18 h测溶圈面积,以不同酶活单位尿激酶的溶圈面积与单位酶活做标准曲线。

1.2.2.2 蚯蚓纤溶酶活性测定 游离酶活性测定方法与1.2.2.1方法相同,测溶圈面积后根据尿激酶标准曲线计算游离酶活性;固定化酶酶活测定是往每孔中加入30 mg固定化酶微球,其它步骤同上。

1.2.3 固定化蚯蚓纤溶酶制备 固定化蚯蚓纤溶酶制备:将从新鲜大豆中提取得到的大豆胰蛋白酶抑制剂溶于pH7.0柠檬酸缓冲液并加入磁性壳聚糖微球,35 ℃水浴振荡偶联后得到偶联大豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球。再按照李菁华[19]实验方法提取得到的蚯蚓纤溶酶粗酶液(测定酶活为10 kU·mL-1)按20∶1的比例添加至上述磁性壳聚糖微球中,30 ℃恒温水浴振荡3 h后洗涤,磁铁分离收集即可得到固定化蚯蚓纤溶酶(测定酶活为160 U·mg-1),置于4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2.4 蚯蚓纤溶酶热失活测定 将按实验方法1.2.3得到的固定化和游离蚯蚓纤溶酶在30、40、50、55、60 ℃下水浴,在0、20、40、60、80、100、120 min时取样,根据1.2.2.2实验方法测定酶活,计算残余酶活比q。

式(1)

式中:c0-不同温度下0 min时酶活,U;ct-t min时酶活,U。

1.2.5 蚯蚓纤溶酶热失活动力学参数的测定 在酶浓度较低时,酶失活主要为热失活现象,并服从一级失活规律,其失活速率用k表示。

式(2)

通过对温度与酶失活影响的研究,蚯蚓纤溶酶的失活速率为:

式(3)

式中:k-酶失活速率常数,min-1,且服从阿伦尼乌斯公式k=k0e-Ea/RT;

对式(3)进行积分求对数得式(4):

lnq=-kt

式(4)

式中:t-酶失活时间,min。

进一步算出这两种酶的半衰期t1/2、ΔH、ΔS、ΔG,计算公式如下:

式(5)

ΔH=Ea-RT

式(6)

式(7)

ΔG=-RT+ΔH

式(8)

式中:t1/2为半衰期,min;Ea为热力学反应活化能,kJ·mol-1;R为气体常数,8.314J·K-1·mol-1;ΔH为焓变,kJ·mol-1;ΔS为熵变,J·K-1·mol-1;ΔG为吉布斯自由焓,kJ·mol-1;H为普朗克常数,1.104×10-35J·min;Kb为玻尔兹曼常数,1.381×10-23J·K-1。

2 结果与分析

2.1 磁性壳聚糖微球的表征

2.1.1 磁性壳聚糖微球红外光谱分析(FT-IR) 磁性壳聚糖微球FT-IR表征如图1所示。图1a中3415 cm-1是N-H和O-H的伸缩振动峰,1617 cm-1是酰胺的特征吸收峰,1431 cm-1是-CH3的特征振动峰,1119 cm-1是C-O的伸缩振动吸收峰,b中620 cm-1处出现了Fe3O4的特征吸收峰,图c中不仅保留了壳聚糖原有的特征峰,且在620 cm-1出现了Fe3O4的Fe-O特征吸收峰,说明制备的磁性壳聚糖微球中包含了Fe3O4和壳聚糖。

图1 磁性壳聚糖微球红外光谱图Fig.1 FT-IR of magnetic chitosan nanoparticles注:a、b、c分别为壳聚糖、磁性Fe3O4纳米粒子和磁性壳聚糖微球的红外光谱图。

2.1.2 磁性壳聚糖微球扫描电镜分析(SEM) 磁性壳聚糖微球SEM表征如图2所示。图2a为放大125000倍的电镜图,图2b为放大5000倍的电镜图。由图2a可知,壳聚糖与Fe3O4纳米粒子形成的复合微粒粒径介于100～300 nm之间,该粒径利于微球在反应体系中分散和磁分离,且小粒径的微球具有更大的比表面积,可以共价结合更多的酶,同时也可以降低底物和产物扩散限制的影响。由图2b可知,磁性壳聚糖微球的粒径分布均匀,分散性较好。

图2 磁性壳聚糖微球电镜图Fig.2 SEM of magnetic chitosan nanoparticles注:a:放大125000倍,b:放大5000倍。

2.2 蚯蚓纤溶酶热失活动力学测定

2.2.1 尿激酶标准曲线 根据1.2.2.1实验方法得到尿激酶标准曲线方程:Y=0.7517X+211.36,R2=0.9944,线性范围为15.5～248 U·mL-1。

2.2.2 蚯蚓纤溶酶热失活测定 根据步骤1.2.4得固定化和游离蚯蚓纤溶酶相对酶活随时间关系如图3所示。由图可知,温度对固定化和游离蚯蚓纤溶酶影响较大,随温度的增大两者相对酶活性减小趋势逐渐增大。当温度达到60 ℃时酶失活现象严重,在60 min内相对酶活急剧下降,60 min后下降趋势稳定。在30 ℃和40 ℃时相对酶活随时间变化很小,50 ℃以上酶失活现象逐渐明显,但是在相同温度条件下,图3b中固定化蚯蚓纤溶酶的相对活性比图3a中游离蚯蚓纤溶酶的相对活性高,说明经磁性壳聚糖微球固定化后的蚯蚓纤溶酶比游离态的蚯蚓纤溶酶热稳定性好。

图3 游离酶和固定化蚯蚓纤溶酶不同温度相对酶活随时间变化曲线Fig.3 The relative activity of free and immobilized earthworm fibrinolytic enzyme at different temperature注:a:游离酶,b：固定化酶,图4、图5同。

2.2.3 蚯蚓纤溶酶热失活动力学参数的测定 将图3中的实验数据代入到步骤1.2.5酶失活动力学方程式(4)中,得到不同温度下lnq与时间t的关系如图4所示。由图可知,从30 ℃到60 ℃,酶活力受温度影响逐渐升高。在30 ℃和40 ℃时酶几乎不失活,随着温度升高酶失活现象越来越明显,所以温度对固定化和游离蚯蚓纤溶酶的活性具有显著的影响。

图4 固定化和游离蚯蚓纤溶酶lnq与时间关系图Fig.4 The curves of lnq for free enzyme and immobilized earthworm fibrinolytic enzyme and time

根据式(4)计算得到lnk与T-1关系如图5所示。

表1 游离酶失活动力学及热力学常数

表2 固定化酶失活动力学及热力学常数

图5 固定化和游离蚯蚓纤溶酶lnk与温度-1关系曲线Fig.5 The curves of lnk for free enzyme and immobilized earthworm fibrinolytic enzyme and T-1

根据图5数据可得固定化和游离蚯蚓纤溶酶失活速率常数和温度关系为:

lnk=-14031/T+38.87(游离酶)

式(9)

lnk=-15688/T+43.39(固定化酶)

式(10)

从式(9)和式(10)可计算得到固定化和游离蚯蚓纤溶酶的酶失活反应活化能分别为130.43 kJ·mol-1和116.65 kJ·mol-1,根据步骤1.2.5式(5)～式(8)算出这两种酶的半衰期,t1/2、ΔH、ΔS、ΔG如表1和表2所示。

根据表1和表2固定化和游离蚯蚓纤溶酶失活动力学及热力学常数可知,随温度的升高,失活速率常数k增加趋势明显。但是相同温度下固定化酶失活速率比游离酶小,说明温度对固定化酶的影响小于对游离酶的影响,经磁性壳聚糖微球固定化后的蚯蚓纤溶酶的热稳定性更好。

3 结论

本研究提取蚯蚓纤溶酶和大豆胰蛋白酶抑制剂,并和磁性壳聚糖微球偶联得到偶联大豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球固定化蚯蚓纤溶酶。通过对磁性壳聚糖微球的表征发现磁性壳聚糖微球粒径分布均匀,成功包裹Fe3O4纳米粒子。再通过比较固定化和游离蚯蚓纤溶酶在不同温度下的热稳定性发现随着温度升高,固定化和游离蚯蚓纤溶酶失活速率加快,但是经磁性壳聚糖微球固定化后的蚯蚓纤溶酶对温度的敏感性要低于游离酶热稳定性更好。动力学分析表明,固定化和游离蚯蚓纤溶酶的表观活化能分别为130.43 kJ·mol-1和116.65 kJ·mol-1。

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Study on thermal stability and thermal inactivation kinetics of immobilized earthworm fibrinolytic enzyme

LEI Jing-ling,ZHAO Zhong-xing*,WANG Chao-yang,ZHU Chang-jie,FENG Li-jin,LU Qiang-ji

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Guangxi University,Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of New Chemical Application Technology in Resources,Guangxi Institute of Science Experimental Center,Nanning 530004,China)

The thermal stability of immobilized and free enzyme were investigated by determining enzyme activity at different temperatures by fibrin plate method,and the thermal inactivation kinetic of immobilized and free earthworm fibrinolytic enzyme was analyzed. The results showed that the relative activity of immobilized and free earthworm fibrinolytic enzyme was gradually decreased and the rate of enzymes rapidly was inactivated with the increasing of temperature,both the activity of free and immobilized enzyme were decreased seriously when the temprature was up to 60 ℃,but the latter showed better thermal stability. Enzymatic kinetics analysis indicated that the apparent activation energy of immobilized and free earthworm fibrinolytic enzyme were 130.43 kJ·mol-1and 116.65 kJ·mol-1respectively between 30 ℃ and 60 ℃。

earthworm fibrinolytic enzyme;immobilized enzyme;thermal stability;kinetic

2015-02-09

雷敬玲(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：生物化工，E-mail：leijingling0524@163.com。

*通讯作者:赵钟兴(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：生物化工，E-mail：zzxx@gxu.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31401629)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)21-0107-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.013