鲟龙鱼硫酸软骨素提取工艺优化研究

周婉君,郝淑贤,吴燕燕,魏 涯,林婉玲,王锦旭,岑剑伟

(中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300)

鲟龙鱼硫酸软骨素提取工艺优化研究

周婉君,郝淑贤,吴燕燕,魏 涯,林婉玲,王锦旭,岑剑伟*

(中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,国家水产品加工技术研发中心,广东广州 510300)

利用响应曲面法优化提取西伯利亚鲟龙鱼软骨组织提取硫酸软骨素的工艺条件。研究了碱浓度、沉淀时间、乙醇体积对硫酸软骨素提取率的影响,在单因素实验基础上采用Box-Behnken中心组合实验,以碱质量浓度、沉淀时间、乙醇体积为影响因素,以提取率为响应值建立二元多次方程,通过响应面分析法得到优化组合。结果表明,最佳工艺条件为:NaOH 0.5mol/L、乙醇体积1倍、沉淀时间20min,提取得硫酸软骨素产率为57.21%,预测值产率为59.31%。

鲟龙鱼,硫酸软骨素,提取,响应曲面法

鲟龙鱼(Acipenser)是淡水类中寿命长、个体大、生长快等养殖优点的鱼类,有很高的科学研究价值和经济价值。近年来,我国鲟龙鱼的养殖业发展迅猛并取得了显著成效[1]。鲟龙鱼骨架为软骨组织,鲟鱼软骨与鲨鱼软骨具有相似功用,内含有丰富的抗癌因子——硫酸软骨素(Chondroitin sulfate)。硫酸软骨素是来自动物鼻软骨、喉软管及肌腱等软骨组织,是从动物软骨组织中提取分离得到的一种重要的酸性粘多糖——糖胺聚糖[2]。根据文献研究发现硫酸软骨素能缓解关节炎[3]、抗氧化、免疫调节、降血脂、抗凝血和促进骨质形成[4],有较好的保水性和黏性、抗肿瘤、抑制病毒活性,因此在医药、保健食品及化妆品行业有广泛应用[5]。从鲟鱼、鲨鱼中提取硫酸软骨素优化工艺虽然已有多种,但是以西伯利亚成年鲟龙鱼进行研究还是极少见。本研究利用西伯利亚成年鲟龙鱼软骨为原料,为了产品的安全性,通过工艺技术研究的改进低碱法优化提取硫酸软骨素,应用响应面分析法(Response Surface Methodolgy)并结合单因素实验对提取工艺进行了优化,确定最佳的提取工艺条件,为鲟龙鱼加工副产物高值化利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西伯利亚鲟龙鱼骨:由杭州千岛湖鲟龙科技开发有限公司,-18℃冻存;十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、氢氧化钠,戊烷磺酸钠,乙酸,甲醇,异丙醇,均为分析纯购自广州化学试剂厂,乙腈(高级纯)购自上海安谱科学仪器有限公司,胰蛋白酶购自广州市齐云生物技术有限公司。

Alpha-4冷冻干燥机 德国Christ公司;3K30冷冻离心机 德国Sigma公司;高速万能搅碎机 上海顶帅有限公司;SCIEN超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;安捷伦1100液相色谱仪 美国安捷伦公司;GB204电子天平 长沙湘平科技发展有限公司;MILLI-Q超纯水机 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 软骨预处理 将鲟鱼软骨组织置于90℃水浴处理20min,用刀刮除表面的肌肉及脂肪等杂质,清洗干净,将软骨切碎,用50℃烘箱干燥后粉碎机打碎,密封-18℃保存。

1.2.2 粗提取 参考尚军等[6]的方法进行超声波水解。称取5g软骨粉,50mL磷酸盐缓冲液,0.015g胰蛋白酶,超声波水解温度50℃,功率100%,时间120min),10000r/min离心15min后取上清液,加入1.0倍体积乙醇和至NaOH 0.4mol/L,搅拌沉淀30min,10000r/min离心20min,取沉淀物用烘箱50℃烘箱干燥约2h。

1.2.3 复溶 用适量水将上述制得的样品完全溶解,用40%的乙酸溶液中和,调pH至中性,冷冻离心机10000r/min离心20min取上清液,-18℃冷冻干燥机干燥24h后,取出研碎混匀,得到硫酸软骨素粗品。

1.3 硫酸软骨素含量及含量的测定

参考液相色谱法[7],用乙腈-10mmol/L戊烷磺酸钠溶液(10∶90),作为流动相;流速为1mL/min;检测波长为205nm;色谱柱为C18柱,250mm×4.6mm,粒度5μm;进样量20μL。

1.4 硫酸软骨素产率计算

根据硫酸软骨素含量测定结果,计算硫酸软骨素含量,计算公式如下:

硫酸软骨素产率(%)=硫酸软骨素粗品质量/软骨质量(干重)×100

1.5 响应面法优化设计

根据预实验结果,选取对硫酸软骨素提取有显著影响的三个因素进行优化,即碱液浓度(X1)、沉淀时间(X2)和乙醇体积(X3)进行响应面实验,选用三因子Box-Behnken[8]数据统计分析软件对实验数据进行回归分析,如表1所示。

表1 实验因素水平表Table1 Factors and levels in response surface design

2 结果与分析

2.1 响应面分析法优化实验结果

选用三因子根据Box-Behnken设计的原理,结合单因素实验结果,确定各影响因素的编号水平。分别为X1碱液浓度(mol/L)、X2沉淀时间(min)、X3乙醇体积(倍)三个响应变量,产率为响应值,响应面设计方案及实验结果见表2[9]。

表2 Box-Behnken实验结果Table 2 Design and results of the response surface

2.2 回归模型方差分析

根据表2的实验设计及实验结果,采用Design-Expert软件对实验数据进行分析,得到方差分析结果见表3[10]。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Variance and error analysis of the response surface

从表3分析结果可知,回归模型Pr>F值为0.0084<0.01,说明回归模型与响应值的相关极显著,模型的相关系数为0.9018>0.9,说明回归模型能够较好地预测相应的响应变量。而失拟项不显著为0.2182>0.05,该模型在理论上反映了响应值的误差较小,拟合度好。

各因素经回归拟合后,可以得到硫酸软骨素含量Y对编码自变量(碱浓度、沉淀时间、乙醇体积)的二次多项回归方程(1):

Y=57.44+5.86X1-1.25X2+2.90X3-0.83X1X2-2.86X1X3+2.64X1X3-7.28X12-0.97X22-5.75X32

由表3可知,碱浓度X1的一次项、碱浓度的X1的二次项及乙醇体积X3的二次项对硫酸软骨素含量的影响显著;碱浓度X1和乙醇体积X3的一次项、三个因素的一次项、沉淀时间X2和乙醇体积X3的二次项对硫酸软骨素含量影响不显著。因此,可得到优化方程(2):

Y=57.44+5.86X1-7.28X12-5.75X32

2.3 响应曲面分析

根据由拟合的回归模型作响应曲面图和等高线图,结果如图1～图3所示。

图1 沉淀时间与碱浓度对产率的影响Fig.1 Effect of precipitation time and alkali concentration on the yield of Chondroitin sulfate

图2 乙醇体积与碱浓度产率的影响Fig.2 Effect of ethanol and alkali concentration on the yield of Chondroitin sulfate

图3 乙醇体积与沉淀时间对产率的影响Fig.3 Effect of ethanol volume and precipitation time on the yield of Chondroitin sulfate

从图1可知,当乙醇体积定为提取液1倍时,碱浓度的变化对硫酸软骨素含量的影响较显著,随着碱浓度增加硫酸软骨素含量先升高后下降。原因是在低浓度碱液中,部分多糖降解不完全或没有降解。从图2可知,乙醇体积和碱浓度的交互作用较小,而碱浓度在0.4～0.6mol/L范围内,硫酸软骨素的含量较大。从图3可知,乙醇体积和沉淀时间对硫酸软骨素含量的交互作用较强,当沉淀时间一定,乙醇体积为0.9～1.1倍左右时,硫酸软骨素含量较高。

2.4 最佳工艺参数确定

为了进一步得到各因素的最佳条件组合,使得提取硫酸软骨素含量达到最佳值,采用Design-Expert软件对各因素和响应值的数据进行优化分析,以硫酸软骨素含量为响应值,经响应面分析可得到最佳的提取条件:碱浓度X1=0.49mol/L、沉淀时间X2=20.36min、乙醇体积X3=0.98倍,硫酸软骨素含量的预测值为59.31%。根据实际操作,将预测条件修正为碱浓度0.5mol/L、沉淀时间20min、乙醇体积1倍,并进行实验得到硫酸软骨素产率为57.21%,结果与理论预测值基本相符,对硫酸软骨素提取低碱处理参数具有一定的实际预测价值。根据文献报道郝淑贤[11]、刘安军[12]、徐传屯[13]等的提取硫酸软骨素产率分别是16.65%、35.70%、31.56%,本研究硫酸软骨素产率结果远远高于其它实验结果,从食品安全方面考虑低浓度碱处理方法较为安全,优化工艺条件更有效地提高了硫酸软骨素的产率和质量。

3 结论

通过采用Box-Behnken的中心组合设计响应面法建立了3个影响因素(碱浓度、沉淀时间及乙醇体积)和响应值(产率)结合相互作用的数学模型,得出碱处理时硫酸软骨素提取条件的优化。三个因素对硫酸软骨素含量的影响顺序:NaOH浓度、乙醇体积、沉淀时间,结果表明,最佳优化工艺条件:NaOH 0.5mol/L、乙醇体积1倍、沉淀时间20min,按此优化工艺条件得到硫酸软骨素产率为57.21%,建立的数学模型能较好地预测各实验因素和考察指标之间的关系。

[1]孙大江,曲秋芝,马国军,等.中国鲟鱼养殖概况[J].大连水产学院学报,2003,18:216-221.

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[3]陈磊,凌培学,张天民. 硫酸软骨素在骨关节炎防止中的作用[J].中国生化药物杂志社,2008,29(2):137-139.

[4]孙丰梅. 硫酸软骨素的提取及其降血脂、抗氧化保健功能的研究[D].保定:河北农业大学,2003.

[5]徐庆阳,黎兴荣,石墨,等. 硫酸软骨素研究现状[J].生物技术通讯,2006,15(6):633-635.

[6]尚军,李来好,吴燕燕,等.响应面优化超声波辅助蛋白酶水解合浦珠母贝肉的条件研究[J].食品科学,2009,30(18):44-49.

[7]中国国家标准化管理委员会.GB/T20365-2006.硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量的测定[S].北京:中国标准出版社,2006.

[8]杨文雄,高彦祥. 响应面法及其在食品工业中的应用[J]. 中国食品添加剂,2005,2:68-71.

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Optimization technology of extractionof the chondroitin sulfate from sturgeon

ZHOU Wan-jun,HAO Shu-xian,WU Yan-yan,WEI Ya,LIN Wan-ling,WANG Jin-xu,CEN Jian-wei*

(South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Laboratoryof Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,National R&D Centerfor Aquatic Product Processing,Guangzhou 510300,China)

Extraction of the chondroitin sulfate in sturgeon was studied by response surface methodology. The influence of alkalinity,sedimentation time,ethanol volume on extract rate of chondroitin sulfate was studied. On the basis of single-factor investigation,Box-Benhnken central composite experiments were carried out to build the quadratic regression model for the extraction yield with above 3 factors,the optimizing process parameters were:alkalinity 0.5mol/L,sedimentation time 20min,ethanol volume 1 times of the extraction solution. Under the optimal processing condition,the yield of chondroitin sulfate was 57.21%,and the forecasted yield was 59.31%.

sturgeon;chondroitin sulfate;extraction;response surface methodology

2015-01-15

周婉君(1961-)，女，本科，实验师，主要从事水产品加工与质量安全控制技术方面的研究。

*通讯作者:岑剑伟(1976-)，男，硕士，副研究员,主要从事水产品加工与质量安全控制技术方面的研究。

国家公益性(农业)行业专项(201003055-06)；国家重大科技成果转化项目(ZD-2013-345-3)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2012YD01)。

TS254.9

B

1002-0306(2015)13-0209-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.035