探讨标本保存时间对异型淋巴细胞形态学改变的影响

曹 科，罗小娟，马东礼，韦 乐，肖丽霞，吴跃平

(广东省深圳市儿童医院检验科 518038)

探讨标本保存时间对异型淋巴细胞形态学改变的影响

曹 科，罗小娟，马东礼△，韦 乐，肖丽霞，吴跃平

(广东省深圳市儿童医院检验科 518038)

目的 探讨以乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝外周血不同保存时间对异型淋巴细胞(以下简称异淋)计数和细胞形态的影响。方法 收集传染性单核细胞增多症(以下简称传单)组(n=32)与对照组(n=35)EDTA-K2抗凝标本共67份，在抗凝0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h分别涂片、染色，各镜检分类200个白细胞，并观察细胞形态的变化。结果 传单组在2.0 h内异淋百分比、凋亡的淋巴细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)，2.0 h后异淋百分比逐渐下降，凋亡的淋巴细胞百分比逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组各时间点间异淋百分比、凋亡的淋巴细胞百分比差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 EDTA-K2抗凝血在2.0 h内不影响异淋计数，异淋易发生凋亡，随着抗凝时间的进一步延长，异淋百分比会逐渐降低，将影响异淋计数的准确性。

外周血；异型淋巴细胞；EDTA-K2抗凝；细胞形态

异型淋巴细胞(以下简称异淋)是在病毒感染、药物反应、过敏原刺激等因素的作用下，淋巴细胞增生并发生形态上的变化，主要表现为胞体的增大、胞质量增加、胞质嗜碱性增强、细胞核母细胞化。异淋常见于各种病毒感染，其中以传染性单核细胞增多症(以下简称传单)时增多较明显。随着检验技术的发展，现在大部分医院均采用具有乙二胺四乙酸盐(EDTA)抗凝剂的真空采血管采集标本后进行血液常规检测，樊笑霞等[1]指出手指末梢血涂片异淋的检出率较EDTA抗凝的标本低很多，异淋形态受EDTA抗凝剂影响较大，故EDTA抗凝外周血不适用于异淋的计数。杨秋连等[2]报道结果得出相反结论，EDTA抗凝血可用于异淋计数的初筛，但当发现血涂片中Ⅱ型异淋较多时，应用新鲜未抗凝血进行异淋复查。薛寒等[3]发现EDTA抗凝剂不影响异淋计数，且在EDTA抗凝后3.0 h内计数结果可信。为进一步明确EDTA抗凝血在保存多长时间后异淋计数会发生变化，细胞形态学又有何改变，现就EDTA抗凝后不同时段异淋计数的差异和细胞形态学的改变进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集本院2012年4～12月符合传单诊断标准[4]的传单患儿乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝标本32例(传单组)，选取同期非传单患儿EDTA-K2抗凝标本35例(对照组)，两组年龄、性别经统计学分析差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 奥林巴斯CX21显微镜、瑞氏染液(参照《全国临床检验操作规程》第3版配制)、EDTA-K2抗凝真空采血管(汕头金丰医疗有限公司生产，内含1.8 mg EDTA-K2干粉，1 mL规格)。

1.2.2 标本收集与处理 每份静脉血标本经EDTA-K2抗凝后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h分别涂片、染色，按照相应标准操作规程[5]完成，由1名技术熟练的主管技师对每张涂片各镜检分类200个白细胞，并观察细胞形态的变化。

2 结 果

2.1 传单组与对照组不同时间点白细胞手工分类结果比较 传单组内不同时间点间的嗜碱性粒细胞百分比(B%)、中性粒细胞百分比(N%)、嗜酸性粒细胞百分比(E%)、单核细胞百分比(M%)、凋亡的中性粒细胞百分比(凋亡N%)比较差异无统计学意义(P>0.05)；淋巴细胞百分比(L%)、异淋百分比(异淋%)、凋亡的淋巴细胞百分比(凋亡L%)差异有统计学意义(P<0.05)；经两两比较，0.5、1.0、2.0 h 3组数据间差异无统计学意义(P>0.05)，与组内其他各组数据比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组内不同时间点间的B%、N%、E%、M%、凋亡N%、L%、异淋%、凋亡L%差异均无统计学意义(P>0.05)。经传单组与对照组组间比较，凋亡L%在0.5、1.0、2.0 h两组数据间差异无统计学意义(P>0.05)，其余时间两组数据间差异有统计学意义(P<0.05)，而凋亡N%在不同时间点两组数据间差异无统计学意义(P>0.05)。经Pearson相关分析，传单组、对照组0.5 h异淋%与不同时间点凋亡L%均无相关性(P>0.05)，传单组、对照组内0.5 h L%与不同时间点凋亡L%均无相关性(P>0.05)。随着EDTA-K2抗凝时间的延长，传单组L%和异淋%逐渐下降，凋亡L%逐渐升高，而对照组无这种趋势。见表1。

2.2 白细胞形态学改变 随着EDTA-K2抗凝时间的延长，传单组部分异淋开始出现凋亡，主要表现为细胞体积缩小、胞质凝缩、染色质凝聚并出现凋亡小体(图1)，中性粒细胞则极少出现凋亡。而对照组的淋巴细胞和中性粒细胞均极少出现凋亡。说明传单组的异淋更易发生凋亡，导致异淋的形态改变，影响异淋计数的准确性。

表1 两组不同时间点白细胞手工分类结果比较(±s)

A：细胞体积缩小，染色质凝聚，胞质见数个较大出芽式的凋亡小体；B：细胞体积缩小，染色质凝聚呈均一致密物，核碎裂为大小不一片段；C：细胞体积明显缩小，染色质凝聚呈均一致密物，胞质见多个细小凋亡小体。

图1 凋亡淋巴细胞(瑞氏染色，×100)

3 讨 论

异淋的形成是由于病毒与B淋巴细胞受体结合，在不断增殖与复制的过程中，被T异淋识别，激发抑制性T细胞(TS/c)增殖并自身发生转化，形成细胞毒效应，出现在循环血液中的大多为受刺激后异常增殖的T细胞和少许B细胞的异淋[6-7]。近年众多研究显示[8-10]，异淋与EB病毒、巨细胞病毒、轮状病毒、支原体等多种病原体感染有关，其中以EB病毒感染最为明显。根据血清学调查，我国3～5岁儿童的血清抗体阳性率达90%以上[11]，可见传单是儿科的常见疾病，异淋计数作为诊断和监测某些病毒感染性疾病疗效简便而有效的指标，已广泛用于临床。因此，保证异淋计数的准确性对临床工作有重要意义。

EDTA是国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐使用的抗凝剂，对血细胞形态影响小，是血液常规检查的首选抗凝剂。近年来，部分学者[1-3]对EDTA抗凝剂对异淋计数的影响做了相应的研究，但结论不太一致。由于正确的标本采集与处理是保证检验结果准确性的重要前提条件。为进一步探讨EDTA抗凝血不同保存时间对异淋计数和形态学的影响，作者做了这方面的研究。

从本研究结果来看，随着EDTA-K2抗凝作用时间的延长，传单组外周血涂片中异淋形态学发生改变，出现了凋亡淋巴细胞，凋亡的细胞形态与王霄霞[12]所描述的一致，并随抗凝时间延长而逐渐增多，而出现的凋亡并不单纯来源于典型的异淋(出现的凋亡淋巴细胞多于减少的典型异淋)，部分不太典型的异淋也出现凋亡。有趣的是对照组凋亡的淋巴细胞并未随着EDTA-K2抗凝时间(在6.0 h内)的延长而升高。说明经EB病毒刺激产生的异淋较正常淋巴细胞更易发生凋亡，异淋在体外某些因素的作用下可能使其凋亡加速，这些因素可能包括：(1)EDTA-K2抗凝剂的刺激；(2)离体血液标本因细胞代谢和(或)抗凝剂导致渗透压、pH的改变；(3)采血试管的接触活化、体内外温度的改变等。这些因素有待进一步研究。而对照组因原本异淋%就很低，而正常淋巴细胞又不易发生凋亡，所以不同时间点间异淋%、凋亡L%差异均无统计学意义(P>0.05)。

本研究结果显示，在EDTA-K2抗凝2 h内异淋计数结果准确，这与之前的研究结果有一定出入，可能的原因有：(1)实验设计的不同，本研究对传单组和非传单分别进行研究，较其他学者不分组进行实验更科学、合理。(2)选取的研究对象的不同。(3)白细胞分类个数、形态学识别能力、异淋判断标准可能有一定差异，本研究每份标本均由同一位技术熟练的工作人员计数200个白细胞进行统计分析，消除异淋判断标准的差异所带来的计数误差，从分析结果来看，除了传单组部分时间点L%、异淋%、凋亡L%结果差异有统计学意义(P<0.05)，其他各组数据差异均无统计学意义(P>0.05)，也可间接证明本研究结果准确、可靠。(4)抗凝剂浓度、抗凝管品牌的差异。

从相关性分析中可知，出现凋亡L%与初始异淋和L%均不相关，但可能与疾病所处时期、体内病毒数量、机体的免疫功能等因素有关，遗憾的是，由于实验设计的缺陷和数据的不完整，作者并未对以上因素进行分析。

总之，本研究结果表明，EDTA-K2抗凝血在2.0 h内不影响异淋计数，随着抗凝时间的进一步延长，因异淋易发生凋亡，异淋%会逐渐降低，影响异淋计数的准确性，但有待进一步扩大样本量进行验证并探讨导致异淋形态学改变(出现凋亡淋巴细胞)的原因。

[1]樊笑霞，吴飞，王凌．EDTA-K2对异型淋巴细胞检测的干扰[J]．第二军医大学学报，2009，30(5)：595-596．

[2]杨秋连，刘军．EDTA-K2对外周血异型淋巴细胞计数的影响[J]．检验医学与临床，2011，8(12)：1463-1464,1466．

[3]薛寒，彭剑虹，黄伏生，等．EDTA抗凝及其保存时间对外周血异型淋巴细胞计数的影响[J]．医学新知杂志，2012，22(2)：122-123．

[4]胡亚美，江载芳．诸福棠实用儿科学[M]．7版．北京：人民卫生出版社，2002：821-827．

[5]叶应妩，王毓三，申子瑜．全国临床检验操作规程[M]．3版．南京：东南大学出版社，2006：123-124．

[6]林培国，杨晓艳，刘瑞明，等．异型淋巴细胞在某些疾病诊断中的意义[J]．江苏医药，2002，28(6)：472．

[7]孙建军，卢洪洲．传染性单核细胞增多症的研究进展[J]．诊断学理论与实践，2009，8(2)：205-207．

[8]郑岚．外周血异型淋巴细胞检测的临床意义[J]．蚌埠医学院学报，2010，35(5)：516-517．

[9]朱云波，夏小梅，李荣龙，等．197例儿童异型淋巴细胞的检测及临床病因分析[J]．中国医学创新，2012，9(20)：94．

[10]张清秀，王艳，李启亮，等．儿童感染性疾病异型淋巴细胞的检测结果及分析[J]．职业与健康，2009，25(2)：120-122．

[11]Chan CW,Chiang AK,Chan KH,et al.Epstein-Barr virus-associated inflectious mononucleosis in Chinese children[J].Pediatr Infect Dis J,2003,22(11):974-978.

[12]王霄霞．外周血细胞形态学检查技术[M]．北京：人民卫生出版社，2010：25-26．

深圳市发改委重点实验室资助项目([2012]866)。 作者简介：曹科(1981-)，本科，主管技师，主要从事临床检验诊断学工作。△

，E-mail:madl1234@126.com。

验交流·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.14.032

R446.11

B

1671-8348(2015)14-1958-03

2014-12-10

2015-03-29)