一种新型藏灵菇乳清粉的制备及其理化成分检测

郭琪祯,梅 俊,李云飞,2,*

(1.上海交通大学农业与生物学院,上海 200240;2.上海交通大学陆伯勋食品安全中心,上海 200240)

一种新型藏灵菇乳清粉的制备及其理化成分检测

郭琪祯1,梅 俊1,李云飞1,2,*

(1.上海交通大学农业与生物学院,上海 200240;2.上海交通大学陆伯勋食品安全中心,上海 200240)

为了得到新型藏灵菇乳清粉并探究其在理化成分上的特殊性,本研究用真空冷冻干燥技术制备得到一种藏灵菇乳清粉(KTWP),并对其水分、灰分、乳糖、蛋白质、氨基酸含量等理化指标进行检测,利用扫描电镜观察藏灵菇内部菌种结构和藏灵菇乳清粉表面结构。研究表明,实验得到的乳清粉中水分4.93%,灰分10.09%,乳糖60.63%,粗蛋白8.65%,符合国标,复水性较好。藏灵菇乳清粉(KTWP)检测出17种水解氨基酸,其中芳香族氨基酸的比率与乳清蛋白粉(WPC-34)相比含量偏高,脂肪族氨基酸比率偏低。新型藏灵菇乳清粉中存在16种游离氨基酸,其种类和含量均高于粗蛋白含量约为34%的乳清蛋白粉WPC-34。

藏灵菇,乳清粉,理化成分,氨基酸,扫描电镜

乳清是奶酪加工的副产物,其不仅保留了牛奶中20%以上的蛋白质,并含有牛奶中全部的乳清蛋白,乳清蛋白被认为是黄金标准蛋白,无论是可溶性还是必需氨基酸的含量均高于酪蛋白等其他蛋白质[1],同时含有脂肪、维生素等营养物质[2]。乳清若处理不当,对环境有一定的破坏作用,但其是功能性蛋白质、肽类、脂质、矿物质和乳糖的极好来源。目前乳清粉及乳清蛋白已经成为具有高价值并被广泛应用的食品原料[3-4]。

藏灵菇菌是用于生产传统低酒精酸牛乳“开菲尔”的发酵剂,呈凝胶状白色或者奶油色,直径为0.3～3.5cm,不规则状[5]。藏灵菇菌在发酵牛乳过程当中,总氮的含量会升高,尤其是水溶性氮和酸溶性氮,增加尤为显著[6],另外有研究表明开菲尔作为一种发酵剂应用在乳制品中能够延长乳制品的货架期[7]。

基于藏灵菇菌的特殊发酵特性,藏灵菇乳清粉会有较特殊的理化特性,尤其是水解氨基酸和游离氨基酸。本研究用真空冷冻干燥的方法制备得到一种新型藏灵菇乳清粉[8],并对其主要理化特性进行检测,为之后对藏灵菇乳清粉的进一步研究做铺垫。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藏灵菇菌 西藏当雄寺庙;UHT无抗纯牛奶 光明乳业;生牛乳 光明乳业牧场;WPC-34 市售(营养指标如表1所示);凝乳酶 美国杜邦化工集团(中国)有限公司;磷酸二氢钙,乙腈(分析纯),三乙胺(分析纯),乳糖(分析纯) 国药集团。

FD-1冷冻干燥机 上海田枫实业有限公司;LD-T250多功能粉碎机 上海顶帅电器有限公司;1.5-10T 1000℃一体型马弗炉 上海慧泰仪器制造有限公司;ATN-300型全自动凯氏定氮仪 上海洪纪仪器设备有限公司;DHG-9240A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;L-8900全自动氨基酸检测仪 日立Hitachi;H-class 超高效液相色谱仪 Acquity ELSD检测器 美国waters;METJLER TOLEDO实验pH计(FE20) 仪器(上海)有限公司。

表1 市售WPC-34营养指标Table 1 The nutritive index of the commercially WPC-34

1.2 实验方法

1.2.1 发酵剂制备 将藏灵菇放置于3%(w/v)无抗纯牛乳中,保持奶温28℃发酵24h,滤出藏灵菇菌,滤出液作为发酵剂[9-10]。

1.2.2 乳清制作 80～85℃加热生牛乳20～30s,冷却至30～35℃,加入8%(g/mL)的发酵剂[9-10],保持奶温30℃发酵1.5h,加入0.55g/L磷酸二氢钙和0.5g/L凝乳酶,搅拌1min,30℃凝乳1.5h,切割,0.5h内将温度从30℃缓慢升至40℃,保持40℃排乳清1.5h,纱布过滤,收集乳清。8500r/min,5℃离心15min,收集黄绿色透明的上清液4℃保存[11]。

1.2.3 乳清粉制作 将乳清倒入培养皿内,保证高度不超过1cm,-80℃急冻2h,转移至真空冷冻干燥箱内,进行真空冷冻干燥12h,收集干燥后的乳清,多功能粉碎机打粉30s,收集乳清粉真空包装4℃保存[12]。

1.2.4 水分、灰分的检测 水分和灰分按照国标方法进行检测[13-14]。

1.2.5 乳糖的检测 色谱条件为:色谱柱:Acquity BEH Amide柱(100mm×2.1mm i.d.;1.7μm;Waters,Milford,MA,USA);流动相:A(乙腈∶水=80∶20 0.2%三乙胺),B(乙腈∶水=30∶70 0.2%三乙胺),A:90%,B:10%;柱温:35℃;样品温度:室温;进样量:2μL;流速:0.13mL/min;ELSD条件:漂移管温度:40℃;载气:氮气;气体压力:40.0Psi;数据率:10pps;喷雾模式:冷却;检测时间:11min;每样进三针。

称取1g乳清粉(精确至0.1mg)于50mL容量瓶中,加15mL加热至50～60℃的水溶解,超声波振荡器震荡10min,用乙腈定容至刻度,混匀后静置数分钟过滤。取5mL过滤液于10mL容量瓶中,用乙腈定容,通过0.22μm滤膜过滤。用于UPLC分析[15]。

配制0.25、0.5、0.667、1、2mg/mL标准乳糖溶液,用于绘制乳糖标准曲线,以峰面积Y为纵坐标,进样量X(mg/mL)为横坐标作图。

1.2.6 粗蛋白的检测 称取2g乳清粉,将样品放入消化管,加入两片消化片,把消化管放入已预热至4200℃的消化炉中,消化2h,样品呈透明绿色液体。取出冷却15min,将消化管放入自动凯氏定氮仪中。加入80mL超纯50mL氢氧化钠、30mL吸收液。关上安全门待仪器自动蒸馏,滴定[16]。

1.2.7 氨基酸检测 通过全自动氨基酸分析仪茚三酮柱后衍生法对乳清中水解氨基酸进行检测分析,每样进三针[17-18]。

标准溶液Amino Acids Mixture Standard Solution,Type H.(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.,Osaka,Japan)配制:取0.400mL氨基酸混合标准溶液用水定容至10.000 mL;氨基酸分析仪分离柱:4.6mm I.D.×60mm L packed with Hitachi custom ion exchange resin(Partical size:3μm);进样量:20 μL;检测波长:570nm(VIS 1),440nm(VIS 2)。

1.2.7.1 水解氨基酸的检测前处理 精确称取15～20mg样品放入水解样品瓶中,加入适量6mol/L HCl溶液,充氮气约8min,密封。将样品瓶放在110℃恒温干燥箱内水解22h。水解结束后,冷却至室温,过滤定容并摇匀。取滤液55℃ 氮气吹干后,用0.02mol/L HCl充分溶解、摇匀,调pH至1.7～2.2之间,用0.45μm滤膜过滤,上机检测。

1.2.7.2 游离氨基酸的检测前处理 称取100mg乳清粉,用超纯水充分溶解,定容至5mL,混匀;取1mL上述溶液,加入2倍体积10%的三氯乙酸,充分混匀,-20℃冷冻静置15min;4℃转速10000r/min离心15min,取上清;用0.22μm滤膜过滤样品,过滤前弃去前3滴;调整样品pH为2.0(用0.02mol/L的盐酸作为基准)。

1.2.8 色氨酸测定 用醋酸铁法测定乳清粉中的色氨酸含量[19]。

1.2.9 藏灵菇和藏灵菇乳清粉扫描电镜检测 将藏灵菇切成片,厚度约5mm,将小片置于pH为6.8的戊二醛中,4℃固定1.5h,用0.1mol/L,pH为6.8的磷酸缓冲液冲洗3次,每次10min。分别用体积分数为50%,70%,80%,90%的乙醇进行脱水,每次10～15min。再用99.5%酒精脱水1h,将脱水后的样品放入ES203(HITACHI)型冷冻干燥仪对样品进行4h干燥处理,将样品观察面向上,粘在扫描电镜载物台上,藏灵菇乳清粉固定后离子膜覆膜机镀金,最后用扫描电镜观察[20]。

2 结果与讨论

2.1 乳清粉

冷冻干燥后的藏灵菇乳清粉(TKWP)为纯白色晶体,可能与冷冻干燥中乳糖无褐变有关[21],复水性较好,TKWP的复水性明显优于喷雾干燥的乳清粉和乳清蛋白粉[22]。

2.2 水分、灰分检测结果

实验得到其水分含量为4.93%,灰分为10.09%,含量符合国标GB11674-2005中对乳清粉的要求[23]。

2.3 乳糖检测结果

根据1.2.5中的条件绘制乳糖标准曲线,如图1所示,得到线性回归方程Y=1.87×107X-5.15×106,R2=0.9956。

图1 乳糖标准曲线Fig.1 Standard curve of lactose

图2为藏灵菇乳清溶液样品的乳糖超高效液相图谱,在第8～9min之间出峰。

图2 藏灵菇乳清粉溶液样品超高效液相色谱图Fig.2 Ultra-high performance liquid chromatogram of Tibetan kefir whey powder

经过积分,三针藏灵菇乳清溶液样品的峰面积的平均值为4607000,带入线性方程得藏灵菇乳清溶液中乳糖的浓度为0.5187mg/mL。样品中藏灵菇乳清粉的浓度为0.8555mg/mL,经过计算此种藏灵菇乳清粉中的乳糖含量为60.63%。

2.4 粗蛋白与氨基酸检测结果

2.4.1 粗蛋白含量测定结果 TKWP的粗蛋白含量为8.65%±0.0933%。

2.4.2 水解氨基酸结果 图3和图4是TKWP和WPC-34的水解氨基酸色谱图,由于检测方法限制(氨基酸检测仪适用于酸水解氨基酸),无法检测出色氨酸,因此用氨基酸检测仪对除色氨酸以外的17种水解氨基酸做了精确的定量。

图5为色氨酸的标准曲线,以吸光度y为纵坐标和色氨酸浓度x为横坐标作图,线性回归方程为y=0.0012x+0.095,R2=0.9994,经过计算KTWP的色氨酸浓度为2278.1825μg/g,WPC-34的色氨酸浓度为5504.0147μg/g。

图3 KTWP水解氨基酸色谱图Fig.3 Amino acid hydrolysis chromatogram of Tibetan kefir whey powder

图4 WPC-34水解氨基酸色谱图Fig.4 Amino acid hydrolysis chromatogram of WPC-34

图5 色氨酸标准曲线Fig.5 Standard curve of Tryptophan

通过SASS软件分析每种水解氨基酸占总水解氨基酸比例,如图6所示,结果显示TKWP和WPC-34的水解氨基酸中有6种氨基酸的含量存在显著性差别(p<0.01)。TKWP水解氨基酸中的脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)和谷氨酸(Glu)在水解氨基酸中的比率显著高于WPC-34,但是其亮氨酸(Leu)、天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)的比率明显低于WPC-34。此外TKWP的游离氨(NH3)的比率是WPC-34的两倍。

分析图6可以发现,KTWP的水解氨基酸中的芳香族氨基酸(色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe)比率均高于WPC-34,脂肪族氨基酸(亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile、丙氨酸Ala、甘氨酸Gly、)均低于WPC-34。

表3 游离氨基酸含量表Table 3 Content of free amino acids

由表2得到KTWP水解必需氨基酸的比率略少于WPC-34的必需氨基酸的比率。

2.4.3 游离氨基酸检测结果 TKWP含有16种游离氨基酸,WPC-34含有11种游离氨基酸(除去游离氨NH3),虽然TKWP的蛋白质含量较低,但是其游离氨基酸种类和含量均高于WPC-34。此外TKWP游离氨基酸必需氨基酸的含量是WPC-34的3倍左右,TKWP的游离氨基酸中必需氨基酸的比率是WPC-34的2倍左右。

图6 KTWP和WPC-34水解氨基酸百分比对比图Fig.6 Percentage comparison chart of hydrolysis amino acid of TKWP and WPC-34

项目TKWP(ng·mg-1)WPC-34(ng·mg-1)酸水解氨基酸含量74019.4070361492.0110色氨酸含量2278.18255504.0147水解氨基酸总量76297.5895366996.0257必需氨基酸/水解氨基酸41.45%45.39%

TKWP和WPC-34的游离氨基酸中谷氨酸(Glu)、磷酰化丝氨酸(P-Ser)的含量较高,其他游离氨基酸的含量存在较大差别。

TKWP和WPC-34存在8种共有的游离氨基酸;TKWP含有7种WPC-34不存在的游离氨基酸,其中的4种为天然氨基酸(天冬氨酸Asp、亮氨酸Leu、酪氨酸Tyr、组氨酸His),包括了1种必需氨基酸(亮氨酸Leu);TKWP和WPC-34相比缺少了3种游离氨基酸,其中的苏氨酸(Thr)为必需氨基酸。

2.5 藏灵菇与KTWP电子扫描显微镜(SEM)扫描结果

实验中所用藏灵菇呈白色,菜花朵状,藏灵菇是一个共生体,由特有的开菲尔多糖形成网络结构,分层较多,每一个分层都具有不同的菌相。同时开菲尔多糖能够保护藏灵菇菌不受外界微生物的侵染,霉菌等不能破坏藏灵菇菌内部,它释放的酶也不能将分层破坏掉。使藏灵菇保持完整的个体。

从图7a可以清晰地看出,藏灵菇内部的优势菌种为杆菌,并有少量球菌,因此可以看出这是一个酵母菌和乳酸菌的共生体系[24]。高洁等[25]曾拍摄过藏灵菇的电镜扫描图,与本实验所拍摄的藏灵菇在菌落数量和分布状态上均有很大的差别,可见藏灵菇的培养环境确实会对其生长造成很大的影响。

图7b是藏灵菇乳清粉表面的SEM图片,在20000的放大倍数下,仍然呈现比较平整的状态,说明此乳清粉的颗粒较小,复水性良好。

图7 藏灵菇和藏灵菇乳清粉扫描电镜结果(20000倍)Fig.7 SEM result of Tibetan kefir and Whey Powder(×20000)

3 结论

3.1 新型藏灵菇乳清粉(TKWP)无颗粒物,复水性较好,含有水分4.92%、灰分10.09%、乳糖60.63%、粗蛋白8.65%,符合国标GB11674-2005。

3.2 TKWP检测出17种天然水解氨基酸,不存在半胱氨酸(Cys)。其谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、游离氨(NH3)在水解氨基酸中的比率显著性高于WPC-34。

与WPC-34相比,TKWP水解氨基酸中的芳香族氨基酸的比率较高,而脂肪族氨基酸的比率偏低。KTWP中必需氨基酸占水解氨基酸的比率也略低于WPC-34。

3.3 TKWP含有16种游离氨基酸,多于WPC-34的11种,其必需氨基酸的含量为WPC-34的3倍左右;游离氨基酸中谷氨酸(Glu)和磷酰化丝氨酸(P-Ser)的含量较高。

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Preparation and physicochemical composition test of Tibetan Kefir whey powder

GUO Qi-zhen1,MEI Jun1,LI Yun-fei1,2,*

(1.School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China;2.Bor Luh Food Safety Center,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China)

In order to produce a new kind of whey powder and explore its particularity in the physical and chemical composition,Tibetan Kefir was chosen as the research object to conduct the investigation. Vacuum freeze-drying method was used to produce this new kind of new whey powder and scanning electron microscope was used to describe the colony distribution inside Tibetan kefir and the surface structure of the Tibetan kefir whey powder. The physical and chemical compositions of Tibetan kefir whey powder were detected and it contained 4.93% moisture,10.09% ash,60.63% lactose and 8.65% crude protein which were in line with the national standard of whey powder. It was found that Tibetan kefir whey powder had excellent solubility and had 17 hydrolysis amino acids in which the ratio of aromatic amino acids was higher than whey powder protein 34 and on the other hand the aliphatic ones was lower. Tibetan kefir whey powder had 16 kinds of free amino acids which was more than whey powder protein 34 no matter on the numbers or species.

Tibetan Kefir;whey powder;physicochemical composition;amino acids;scanning electron microscope

2014-08-20

郭琪祯(1990-)，女，硕士研究生，研究方向:食品工程。

*通讯作者:李云飞(1954-)，男，博士，教授，研究方向:食品质构与流变学。

十二五“国家科技支撑计划”项目子项目(2013BAD18B02)。

TS252.42

A

1002-0306(2015)11-0088-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.010