CCR-2在胶质瘤血管生成中的作用机制研究*

丁山

胶质瘤是人体血管化程度最高的肿瘤，其具有高复发率的临床特点，新生的血管不仅为肿瘤的生长提供营养支持，还构成了肿瘤侵袭的途径，单核细胞趋化因子MCP-1是CC趋化因子超家族重要成员，在肿瘤细胞中可高表达MCP-1及其受体CCR-2[1]。研究表明小胶质细胞及巨噬细胞中CCR-2表达升高[2]。本研究提出胶质瘤细胞可能通过MCP-1/CCR-2途径改变胶质瘤血管生成的微环境，参与胶质瘤细胞侵袭，从而更好的解释CCR-2在胶质瘤血管生成中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、细胞与仪器 试剂：胶质瘤细胞系N9细胞（中国科学院细胞库），含血清的完全培养基及不含血清培养基（美国GIBCO公司），PCR试剂盒（上海硕盟生物），免疫组化试剂盒（武汉博士德），HRP标记山羊抗小鼠IgG，HRP标记山羊抗兔IgG（上海碧云天生物），含EDTA的胰酶（美国GIBCO公司），一抗：VEGF、IL-8兔单克隆IgG和β-actin小鼠多克隆IgG（美国Santa Cruz公司）。仪器：细胞培养超净台（苏州净化），培养箱（美国Queue systems），倒置相差显微镜（日本奥林巴斯），高转速冷冻离心机（德国BiofugeStratos），-80℃ -4 ℃冰箱（日本松下），高压消毒箱（美国Tuttnauer），转膜仪及电泳仪（美国伯乐公司），PCR仪（澳大利亚Rotor-gene）。

1.2 细胞培养与传代 胶质瘤细胞系N9细胞培养于含10%胎牛血清及双抗的DMEM培养基中，置于5% CO2、37 ℃孵箱中传代培养。当细胞密度达到4×106以上的时候进行传代，清洗培养基后，用含0.02% EDTA的胰蛋白酶进行细胞消化，倒置显微镜观察细胞回缩即终止消化，加入同体积的有血清培养基，吹打，5 min 10 000 r/min离心，弃上清，取细胞悬液，计数后接种到新的培养瓶中。

1.3 CCR2活化 待细胞贴壁生长至4×106，对照组细胞用常规培养基，观察组运用MCP-1处理细胞，50 ng/mL MCP-1分别于0、12、24、36、48 h诱导活化，提取培养上清用于检测VEGF、IL-8蛋白分泌情况，细胞用于提取RNA，以分析VEGF、IL-8 mRNA的表达。

1.4 免疫组化方法 采用SP检测法，加入3%过氧化氢封闭阻断内源性过氧化物酶，50 μL非免疫动物血清封闭，加50 μL VEGF、IL-8一抗过夜，50 μL生物素标记第二抗体，辣根过氧化物酶孵育，DBA显色，苏木素复染，中性树胶固封。结果判定：阳性细胞为细胞胞浆胞膜在倒置显微镜下出现深棕黄色的染色。

1.5 RT-PCR（半定量逆转录聚合酶链反应）方法 提取总RNA。取2 μg总RNA行逆转录cDNA，取20 μL作为反应体系。PCR反应由逆转录产物2 μ以及18sRNA和VEGF、IL-8的引物共同组成。反应过程按照标准的RT-PCR步骤进行：首先预变性的反应条件为95 ℃、5 mins，接着进行梯度变性反应，共进行30次的循环。接着对所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过拍摄电泳图像对所得到的电泳结果进行凝胶成像分析系统分析。内参选择18sRNA作为参照，同样完成以上PCR系统的成像，对得到的半定量结果进行对比分析，通过量化的吸光度积分值进行分析（A值）。

1.6 Western blotting方法 提取上清蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳，半干法转膜，加VEGF、IL-8一抗（1∶500），4 ℃孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶1000）37 ℃孵育1 h。ECL光化学法显色，用彩色图像分析系统测定吸光度。

1.7 统计学处理 所有采集的数据使用SPSS 21.0统计软件进行分析。其中对符合正态分布资料的数据采用（±s）表示，对非正态分布数据采用中位数和四分位数间距来表示。遵循正态分布而且方差齐性，两两比较采用LSD检验。非参数检验法对不同时间所表达的mRNA的量和蛋白的量进行比较，应用Kruskal-wallis H检验进行多组间数据的比较，应用Mann-whitney U检验法进行数据比较，具有统计学差异的以P<0.05表示。

2 结果

2.1 免疫组化法检测CCR-2在胶质瘤细胞系N9细胞中表达情况 取5张片，每张片取5个视野，取平均值。阳性表达以细胞核着色为主，其阳性细胞数评分：<5%计为0分，6%~25%计为1分，26%~50%计为2分，51%~75%计为3分，>75%计为4分；染色的着色评分：不着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。最后的结果评判阳性率和着色的强弱相加之和为总得分，0分的计为阴性组“-”，1~2分的计为弱阳性组“+”，3~4分的计为阳性组“++”，5~7分的计为强阳性组“+++”。CCR-2在胶质瘤细胞系N9细胞中有较高的阳性表达，共46个细胞，-4个，+15个，++17个，+++10个，占91.30%。

2.2 RT-PCR检 测MCP-1活 化CCR2后VEGF和IL-8mRNA表达水平 经过活化之后可以增加N9细胞的VEGF和IL-8mRNA表达水平，与未活化组相比差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.3 通过Western blot法检测MCP-1活化CCR2后VEGF和IL-8的蛋白表达水平 经过活化之后可以增加N9细胞的VEGF和IL-8蛋白表达水平，与未活化组比较差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。

表1 RT-PCR检测MCP-1活化CCR2后VEGF和IL-8mRNA表达水平（x-±s）

表2 Western blot法检测MCP-1活化CCR2后VEGF和IL-8的蛋白表达水平（x-±s）

3 讨论

胶质瘤是人体血管瘤中一种复发率较高的肿瘤，以新生血管的快速增长为主要病理特征，新生血管不仅给肿瘤提供营养支持还可以构成肿瘤外周组织侵袭的途径[3]。单核细胞趋化蛋白1-MCP-1是CC趋化因子超家族的主要成员，其受体为CCR2。已有研究表明两者与肿瘤细胞浸润有着密切的关系[4]。胶质瘤患者的脑脊液中存在MCP-1及CCR2的高表达，过表达CCR2还存在于胶质瘤祖细胞中，因此本研究通过探讨单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）受体CCR-2在胶质瘤血管生成中的作用，为更好的研究其在肿瘤复发中的机制。

血管的生成在肿瘤的转移、侵袭中发挥着重要的作用，但是其始动细胞一直是肿瘤血管生成的关键科学问题[5]。VEGF和IL-8是两种重要的促进血管生成因子，可直接刺激内皮细胞表面的受体，发挥内皮细胞生成、增殖及迁移的作用[6]。本研究结果显示，CCR-2在胶质瘤细胞系N9细胞中有较高的阳性表达，经过活化之后可以增加N9细胞的VEGF和IL-8mRNA及蛋白表达水平，与未活化组相比差异具有统计学意义。研究提示，胶质瘤细胞中CCR2活化可以促进血管内皮因子及白细胞介素-8的表达，进而具有促进血管生成的作用。胶质瘤形成是CCR2通过MCP-1活化发挥血管生成作用的。

综上所述，胶质瘤的生成中促血管生成因子之间的调控是关键因素，在今后的抗肿瘤药物研发方面应将促血管生成因子考虑到其中，更有效地抑制血管地生成，更好地发挥对肿瘤生长发展和迁移的抑制作用。

[1] Jiao B， Wang Y S， Cheng Y N， et al. Valsartan attenuated oxidative stress， decreased MCP-1 and TGF-beta1 expression in glomerular mesangial and epithelial cells induced by high-glucose levels[J]. Biosci Trends，2011，5（4）：173-181.

[2] Izhak L， Wildbaum G， Jung S， et al. Dissecting the autocrine and paracrine roles of the CCR2-CCL2 axis in tumor survival and angiogenesis[J]. PLoS One，2012，7（1）：e283 05.

[3] Suresh N M， Saafan Z M， Nicolas C R， et al. Role of monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1/CCL2） in migration of neural progenitor cells toward glial tumors[J]. J Neuro Res，2009，87（7）：1547-1555.

[4] Dutra R C， Claudino R F， Bento A F， et al. Preventive and therapeutic euphol treatment attenuates experimental colitis in mice[J]. PLoS One，2011，6（11）：e271 22.

[5] Wang K， Niu J， Kim H， et al. Osteoclast precursor differentiation by MCPIP via oxidative stress， endoplasmic reticulum stress， and autophagy[J]. J Mol Cell Biol，2011，3（21）：360-368.

[6] Bhardwaj S， Roy H， Babu M， et al. Adventitial gene transfer of VEGFR-2 specific VEGF-E chimera induces MCP-1 expression in vascular smooth muscle cells and enhances neointimal formation[J].Atherosclerosis，2011，219（123）：84-91.