基于UPLC指纹图谱和判别分析鉴别黄芩产地研究

苏建春，柯华香，赵俊霞，孙彩霞，尹蓉莉*，李 化

(1.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137；2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700； 3.中国中医科学院 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700； 4.西华大学 生物工程学院，四川 成都 610039)



基于UPLC指纹图谱和判别分析鉴别黄芩产地研究

苏建春1,2，柯华香2,4，赵俊霞1，孙彩霞1，尹蓉莉1*，李 化2,3*

(1.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137；2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700； 3.中国中医科学院 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700； 4.西华大学 生物工程学院，四川 成都 610039)

目的：利用超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱技术结合判别分析方法建立黄芩产地快速鉴别方法。方法：色谱柱为Aquity BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)，流动相为0.1% 甲酸水溶液-乙腈梯度洗脱，流速为0.4mL/min，柱温为40℃，检测波长为280nm。采用UPLC法对河南、甘肃、山西、河北、山东5省份64批黄芩样品进行测定，利用中国药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》(2004版A)对其进行相似度评价，并结合Fisher线性判别函数建立黄芩产地快速鉴别模型。结果：不同产地黄芩药材的指纹图谱相似度大于0.95；判别分析结果显示河南、山东、河北3省份的黄芩可被准确区分开来，山西、甘肃各有一批次黄芩出现误判，各模型判断正确率均大于94.7%。结论：利用超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱技术结合判别分析方法鉴别黄芩产地快速、准确，值得推广。

黄芩；UPLC指纹图谱；相似度评价；判别分析

黄芩为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi.) 的干燥根，其药用历史悠久，历代本草书籍均有记载，其性苦、味寒，归肺、胆、脾、大肠、小肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效[1]。我国幅源辽阔，黄芩在全国各地均有分布，主产于河北、山西、山东、甘肃、河南等地。不同的地理位置、生态环境对黄芩药材质量有很大影响，已有学者发现不同产地黄芩在产量、性状、质量上存在较大差异[2]。现代药理学研究表明，不同产地黄芩的抑菌、抗炎、解热、镇静等活性作用也存在差异[3-6]，可见产地对黄芩质量及功效有一定影响。

指纹图谱在化学成分类型分析、药材间差异及质量控制方面发挥着重要作用。肖丽和等[7]采用系统聚类法对15批不同来源不同种属的黄芩药材进行了分类判别。肖蓉等[8]采用系统聚类法对承德地区与其他地区的黄芩药材进行了分类判别。目前研究主要集中在对不同产地不同种属黄芩药材的小样本无监督系统聚类分析方面，未见采用判别分析方法对不同产地大样本量正品黄芩进行产地判别的报道。鉴于此，本研究收集了河北、山西、山东、甘肃、河南5个省份 64 批黄芩药材，建立了黄芩药材UPLC指纹图谱分析方法，在数据化处理的基础上进行了相似度评价和判别分析研究，以期为黄芩产地的快速鉴别提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters ACQUITY H-Class UPLCTM 超高效液相色谱仪(包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower Ⅱ色谱工作站)；2004 MP6 型半微量电子显示天平(德国Sartorius公司)；Scout Pro 型电子天平(美国Ohaus公司)；KQ-100DE 型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；超纯水仪Milli-Q 型超纯水制备仪(法国Millipore公司)。

1.2 试药

黄芩苷(批号E-0050，纯度≥98%)、汉黄芩苷(批号E-0664，纯度≥98%)、黄芩素(批号E-0051，纯度≥98%)、汉黄芩素(批号E-0103，纯度≥98%)均购自上海同田生物技术股份有限公司；千层纸素 A (批号20120129，纯度≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，超纯水由Milli-Q纯水机制备。

本实验收集了河南、甘肃、山东、山西、河北 5 省份的黄芩药材共计 64 份，药材来源见表1 。全部药材均经中国中医科学院中药研究所李化副研究员鉴定为唇形科植物黄芩S.baicalensisGeorgi.的干燥根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Aquity BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱：0～0.5min (82%A)，0.5～2min (82% ～80%A)，2～6min(80%～70%A)，6～8min(70%A)，8～10min(70%～40%A)，10～12min (40%A)；柱温：40 ℃；流速：0.4mL/min；检测波长：280nm；进样体积：1μL；色谱运行时间：12.5min。

表1 黄芩样品来源

注：hn 代表河南产黄芩；sd 代表山东产黄芩；hb 代表河北产黄芩；sx 代表山西产黄芩；gs代表甘肃产黄芩。

2.2 对照品溶液制备

取适量黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素对照品，分别配制成质量浓度为87.20μg/mL、39.60μg/mL、41.20μg/mL、3.34μg/mL和1.57μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取黄芩粉末约0.05g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加体积分数70%乙醇50mL，称定重量，超声提取60min，放冷，称重，以体积分数70%乙醇补足失重，滤过，续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度实验 取黄芩粉末约0.05g，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制样，连续进样 6 次，记录指纹图谱。各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD 分别小于0.2%和3.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性实验 取黄芩粉末约0.05g，共6份，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制样，分别进样，记录指纹图谱。各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD 分别小于0.2%和5.0%，表明该测定方法重现性良好。

2.4.3 稳定性实验 取黄芩粉末约0.05 g，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制样，分别于 0、2、4、6、8、10、12h进样检测，记录指纹图谱。各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别小于0.8%和5.0%，表明供试品溶液在室温下放置12h稳定性良好。

2.5 指纹图谱建立

2.5.1 黄芩样品UPLC指纹图谱样品测定 分别取 64 批黄芩样品，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样量为1μL，记录UPLC色谱图。在相同色谱条件下测定对照品溶液，并对供试品中各峰进行指认。通过对照品指认，3 号、9 号、11 号、12 号、13 号色谱峰分别为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A。通过质谱鉴定，5 号、8 号色谱峰分别为去甲汉黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷。混合对照品和黄芩药材UPLC色谱如图1所示。

2.5.2 参照峰选择 汉黄芩苷(9号峰)是黄芩的主要有效成分，在各批次样品中均能被检测到，分离度较好，且该色谱峰峰面积和保留时间适中且较稳定，故选择汉黄芩苷色谱峰作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.5.3 指纹图谱建立 采用中国药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》( 2004 版A) 对64批黄芩药材进行指纹图谱分析，得到吸收强、特征明显且稳定性较好的14个色谱峰作为共有峰(见图1)。以第 S14 批(hb-6，河北滦平)药材图谱作为参照谱，选取“时间窗宽度”为0.1min，采用中位数法计算，选定14个共有峰进行多点校正，自动匹配，匹配后的 64 批样品色谱见图2 。

图1 混合对照品溶液(A)和黄芩样品溶液(B)UPLC色谱

注：3-黄芩苷，5-去甲汉黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷，8-千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷，9-汉黄芩苷，11-黄芩素，12-汉黄芩素，13-千层纸素 A

图2 64批不同产地黄芩药材的UPLC指纹图谱

3 数据分析

3.1 指纹图谱相似度分析

采用中国药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度软件，以第 S14 批(hb-6，河北滦平)药材图谱作为参照谱，对所得UPLC色谱指纹图谱进行相似度分析，以相关系数表征相似度， 64 批不同产地黄芩样品相似度值均在 0.950 以上，说明不同产地黄芩药材相似度较高。

3.2 指纹图谱差异性分析

利用中药色谱指纹图谱相似度软件分别生成河南、山东、河北、山西、甘肃 5 个省份的对照指纹图谱，得到5个省份的对照指纹图谱如图3所示。对所建立的对照指纹图谱进行分析比较，可知甘肃、山西产黄芩在2号、3号色谱峰间出现的色谱峰数目较多，河南、山东、河北产黄芩则相对较少。甘肃产黄芩样品部分未检测到 a、b、c、d 号色谱峰组分，而河南、山东、河北、山西产黄芩样品则可同时检测到1～14号共有峰以及 a、b、c、d 号色谱峰(见图3)。

以峰面积标示含量，比较不同产地黄芩各色谱峰峰面积，结果显示不同省份黄芩样品黄酮苷类成分(1～9号峰)的峰面积按照河南、山东、河北、山西、甘肃的顺序依次递减。黄酮苷元类成分(10～14号峰)峰面积亦按照河南、山东、河北、山西、甘肃的顺序依次递减。可见不同产地黄芩存在一定差异，可用于进一步鉴别其产地。

图3 产地河南、山东、河北、山西、甘肃黄芩药材对照指纹图谱

3.3 黄芩药材产地判别分析

应用IBM SPSS Statistics 19.0 统计学软件，采用判别分析方法对64批不同产地的黄芩指纹图谱数据进行判别。将黄芩指纹图谱中 14 个共有峰的相对峰面积数据导入 SPSS 软件中，按照所有达到容许度标准的自变量同时进入判别方程的方法处理变量，进行Bayes判别，可得到河南、甘肃、河北、山东、山西 5 省份黄芩的 Fisher 线性判别函数，公式如下：

Y山西=-187.92+285.40X1-938.92X2+28.64X3-285.91X4+277.02X5+1607.19X6+504.56X7+286.40 X8-402.10X10+36.33X11+574.99X12-1880.64X13-1150.59X14

Y甘肃=-170.41+346.70X1-1285.50X2+38.03X3-67.54 X4+278.79X5+1252.33X6+325.32X7+246.99 X8-308.75 X10+48.38 X11+588.55X12-2009.23X13-1370.30X14

Y山东=-204.64+353.43X1-1184.66 X2+26.83X3-458.84 X4+219.68X5+2084.52X6+626.54X7+294.56X8-401.32X10+36.92 X11+580.01X12-1986.83X13-1073.28X14

Y河南=-203.40+227.27X1-912.59 X2+17.47X3+110.59 X4+422.45X5+1697.13X6+376.36X7+278.26X8-283.36X10+27.01 X11+623.51X12-1882.00X13-1169.14X14

Y河北=-232.06+328.39X1-1200.62 X2+29.85X3-120.75 X4+376.21X5+1865.62X6+359.33X7+323.41X8-562.60X10+43.69 X11+689.44X12-2239.54X13-1357.42X14

为验证该判别函数的正确性，采用SPSS 19.0 软件提供的训练样本回代法对判别函数进行验证，结果见表2。验证结果表明不同产地黄芩药材样品总判断正确率为96.9%，其中河南、山东、河北产黄芩判断正确率均为100%，山西、甘肃产黄芩各有一批出现误判，判断正确率分别为96.3%和94.7%，说明该实验建立的判别函数基本稳定，可用于黄芩产地的快速判别。

表2 不同产地黄芩 Fisher 判别函数交互验证结果

4 讨论

本研究选择的黄芩药材皆为药典收载的正品ScutellariabaicalensisGeorgi黄芩，样品遗传差异性较小，药材中化学成分的差异主要由生长环境的不同造成。不同产地、气候条件导致黄芩自身次生代谢产物积累的不同，各省份黄芩化学成分具有一定地域特征，但以往研究仅以黄芩苷含量作为评价指标，具有一定局限性。本实验结合黄芩指纹图谱分析，所建立的判别函数的回判正确率达 96.9%，可有效对黄芩样品的产地进行判别。对未知样品进行判别时，只需按照本实验的色谱方法测定样品，然后将相应共有峰的相对峰面积值代入上述判别方程，比较判别函数值的大小，值大者则为该省份的黄芩，该方法简单、快速。

鉴于目前实验收集的样本数量还相对较少，每个产区的样品量不均衡，后续实验要进一步增加样本量，不断修正判别函数模型。以期通过本研究提出一种思路，建立一种有效的数学模型，为快速准确鉴别中药材产地提供参考。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010:282-283.

[2] 于晶,陈君,肖新月,等.不同来源黄芩产量及质量性状的比较研究[J].中国中药杂志，2005,30(7):491-494.

[3] 刘菊福,卢长安,廖福龙,等.不同产地黄芩提取物主要药效作用的比较[J].中国中医药信息杂志,2001,8(3):28-30.

[4] 吴再旺,王喆明,卢月,等.道地与非道地黄芩的药效比较[J].中国中药杂志,2012,37(23):3628-3632.

[5] 徐珊,孟庆刚,徐琳莉,等.不同来源的黄芩提取物解热药效差异比较[J].中华中医药学刊,2009,27(6):1176-1180.

[6] 宋旦哥.基于不同来源的黄芩物质基础与药效学相关性研究[D].北京:北京中医药大学,2010:53-62.

[7] 肖丽和,王红燕,李发美,等.不同来源黄芩药材HPLC指纹图谱比较[J].沈阳药科大学学报,2004,21(1):28-31.

[8] 肖蓉,袁志芳,王春英,等.不同产地黄芩药材HPLC指纹图谱的研究[J].中草药,2005,36(5):743-747.

(责任编辑：尹晨茹)

Identification of Scutellaria baicalensis from Different habitats Using UPLC Fingerprints in Combination with Discriminant Analysis

Su Jianchun1,2,Ke Huaxiang2,4,Zhao Junxia1,Sun Caixia1,Yin Rongli1*, Li Hua2,3*

(1.Chengdu College of TCM, Chengdu 611137,China;2.Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;3.State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;4.Bio-Engineering College，Xihua University,Chengdu 610039,China)

Objective:To set up the ultra performance liquid chromatography(UPLC)fingerprints of Scutellaria baicalensis Georgi (SBG) collected from different habitats so as that we could quickly and effectively discriminate SBG by UPLC fingerprint and discriminant analysis. Methods:The UPLC separation was performed on a Aquity BEH C18analytical column gradient eluted with acetonitrile -0.1% formic acid at the flow rate of 0.4mL/min .The temperature of column was 40℃. The PDA detection wavelength was 280nm .UPLC fingerprint was adopted to analyze 64 batches of SBG collected from different habitats.The similarity was evaluated according to the software‘Herb Fingerprint Similarity Assessment System’(2004A) ,and Fisher’s linear discriminant functions were established by discriminant analysis.Results:The similarity index of 64 batches SBG is greater than 0.95. The experimental results indicated that the samples collected from Henan, Shangong and Hebei provinces could be distinguished completely. The accuracy of geographical tracing prediction model of every provinces is greater than 94.7%Conclusion:Combining to the discriminant analysis,we could quickly and effectively discriminate SBG by UPLC fingerprint.This method can be used for origin identification of SBG collected from different habitats.

ScutellariabaicalensisGeorgi(SBG);UPLC; Fingerprint Chromatography; Discriminant Analysis

2014-12-08

国家自然科学基金项目(81202903)；科技部中医药行业科研专项(201407003)

苏建春(1987-)，女，满族，成都中医药大学硕士研究生，研究方向为中药新剂型、新制剂、新技术研究以及中药复方质量评价与物质基础研究。

尹蓉莉，成都中医药大学教授，研究方向为中药新剂型、新制剂、新技术。E-mail:yinronglili@163.com；李化(1976-)，博士，中国中医科学院中药研究所副研究员，研究方向为中药及其复方质量评价与药效物质基础。E-mail:lihua621@hotmail.com

R284.1

A

1673-2197(2015)04-0024-04

10.11954/ytctyy.201504012