24-乙酰泽泻醇A对Ox-LDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响

周晓茂，薛偕华

(1．福建中医药大学 康复医学院，福建 福州 350003； 2．福建中医药大学附属康复医院 脑病科，福建 福州 350003)



24-乙酰泽泻醇A对Ox-LDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响

周晓茂1，薛偕华2*

(1．福建中医药大学 康复医学院，福建 福州 350003； 2．福建中医药大学附属康复医院 脑病科，福建 福州 350003)

目的：探讨24-乙酰泽泻醇A对氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导的大鼠血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响，阐明其抗动脉粥样硬化的作用机制。方法：采用酶消化法培养大鼠VSMCs，在Ox-LDL(50mg/L)、24-乙酰泽泻醇A(10μg/mL)作用下，将所有大鼠分为空白对照组、Ox-LDL组和泽泻A组三组，采用RT-PCR方法检测平滑肌细胞MMP-9中mRNA的表达，采用Western blotting法检测MMP-9蛋白表达的变化。结果：与空白对照组比较，Ox-LDL刺激平滑肌细胞，MMP-9中mRNA和蛋白的表达上调(P<0.05)；24-乙酰泽泻醇A(10μg/mL)可抑制Ox-LDL诱导的平滑肌细胞MMP-9中mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论：24-乙酰泽泻醇A可抑制Ox-LDL诱导的大鼠平滑肌细胞迁移，抑制其MMP-9表达，为动脉粥样硬化的临床治疗提供新方法。

24-乙酰泽泻醇A；血管平滑肌细胞；基质金属蛋白酶-9

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)为心脑血管疾病的主要病理基础，研究表明氧化损伤在AS及其并发症的发生和发展过程中起着重要作用[1]。氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)可促进泡沫细胞形成及血管平滑肌细胞的增殖和迁移，导致动脉粥样硬化[2]。细胞外基质(Extracellular matrixc,ECM )和基底膜的降解则是平滑肌细胞(VSMCs)迁移的前提条件。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)是一个蛋白酶家族，由巨噬细胞、VSMCs等细胞产生，可广泛降解ECM。其中，MMP-9为MMPs家族的重要成员，在VSMCs迁移至血管内膜、新生内膜形成、血管重构及不稳定性斑块破裂等过程中发挥着重要的促进作用[3-4]。泽泻为利水渗湿之要药，24-乙酰泽泻醇A为泽泻中含有的主要萜类有效成分。研究表明，泽泻中三萜类化合物具有利尿、降血脂、抗动脉粥样硬化等作用[5-6]。目前，24-乙酰泽泻醇A抗As的作用机制尚不清楚，未见其对MMP-9表达影响的相关研究。本研究以Ox-LDL诱导的大鼠VSMCs为模型，观察24-乙酰泽泻醇A对VSMCs迁移MMP-9表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM/F-12培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；清洁级SD雄性大鼠4只，购自福建医科大学实验动物中心(许可证号：SCXK(闽)2012-0001)；氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL，1.32mg/L)(北京协生生物科技公司)；24-乙酰泽泻醇A(上海康标有限公司)；RT-PCR试剂盒、Trizol(Promega公司)；MMP-9 PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；ECL试剂(北京碧云天有限公司)；山羊抗兔二抗(碧云天生物技术研究所)；兔抗大鼠MMP-9、β-actin一抗(CST公司)；Western blot电泳设备(Bio-RAD公司)；细胞培养箱(Therom公司)；Leica DMIL LED倒置显微镜。

1.2 大鼠VSMCs分离及培养

雄性SD大鼠以颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离出胸主动脉，刮去内、外膜，将组织剪成1mm×1mm大小的组织块,加入II型胶原酶，37℃下消化30min，加入浓度为20%的胎牛血清DMEM液，置于37℃、5%CO2孵箱中培养5～7天，细胞从组织块周围爬出并生长融合、传代，用浓度为10%的胎牛血清DMEM液培养，每隔2～3天换液1次，胰酶消化传代。3～6代细胞用于实验研究。

1.3 细胞干预分组

取“1.2”项对数生长期细胞，接种于6孔培养板培养24h，换不含血清DMEM液培养24h，使细胞生长同步于G0期。根据不同处理将细胞分为三组：(1)空白对照组：不加任何干预剂，24h后收集细胞；(2)Ox-LDL组：加Ox-LDL(50mg/L)，24h后收集细胞；(3)泽泻A组：24-乙酰泽泻醇A 10μg/mL预孵育1h，然后加Ox-LDL(50mg/L)刺激，24h后收集细胞。每组实验均重复3次。

1.4 RT-PCR检测MMP-9 mRNA的表达

用Trizol试剂(Gibco公司)提取总RNA，取1μg各组细胞总RNA逆转录合成cDNA，再各取2μL逆转录产物分别进行PCR。MMP-9的引物序列为：上游引物为5-CAAGGACGGTCGGTATTGGAAG-3，下游引物为5-AAACGAGTAACGCTCTGGGGAT-3，扩增片段长度为348bp；内参照GAPDH引物序列为：上游引物为5-GTGGAGTCTACTGGCGTCTTC-3，下游引物为5-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT-3，扩增片段长度为149bp。扩增条件：95℃变性45s；54℃退火45s；72℃延伸1min；30个循环，72℃延伸2min。取3μL产物，在1.5%琼脂糖凝胶中电泳(100 V)18min，紫外灯下拍照，对电泳带进行吸光度扫描，以MMP-9/GAPDH代表MMP-9中mRNA的相对表达量。实验独立重复3次。

1.5 Western blot检测MMP-9、p-ERK和ERK蛋白的表达

细胞经胰酶消化后吹打离心，加100μL裂解缓冲液裂解，充分研磨后离心，吸取上清液，测样品蛋白变性，SDS-PAGE电泳，转膜后将PVDF膜取出用封闭液封闭2h，分别加入抗MMP-9、 β-actin(1∶1 000)抗体孵育，4℃下过夜，室温下加入相应二抗(1∶5 000)60min。将PVDF膜放图像扫描仪上，避光配置显色液并覆盖PVDF膜，反应1min后运用Image-lab软件进行分析处理。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠VSMCs培养与鉴定

倒置相差显微镜下，单个平滑肌细胞呈梭形或不规则三角形，有多个细胞突起，胞质丰富，密度高，核圆形居中。生长融合后呈典型“峰谷征”。见图1。

图1 原代大鼠VSMC细胞形态学鉴定：普通光镜下细胞融合后呈“峰谷征”(×100)

2.2 24-乙酰泽泻醇A对Ox-LDL诱导的VSMCs MMP-9 mRNA表达的影响

空白对照组VSMCs存在着MMP-9 mRNA的基础表达；加入Ox-LDL(50mg/L)处理24h后，MMP-9 mRNA表达明显上调(P<0．05)。24-乙酰泽泻醇A(10μg/mL)预孵育VSMCs1h，Ox-LDL诱导的VSMCs MMP-9 mRNA表达上调可部分抑制(P<0．05)。GAPDH作为内参。见图2。

图2 平滑肌细胞MMP-9 mRNA表达

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与Ox-LDL组比较，#P<0.05。

2.3 24-乙酰泽泻醇A对Ox-LDL诱导的VSMCs MMP-9 蛋白表达的影响

与空白对照组比较，Ox-LDL(50mg/L)刺激下VSMCs的MMP-9蛋白水平显著升高(P<0.05)。24-乙酰泽泻醇A(10μg/mL)预孵育VSMCs 1h亦可明显抑制Ox-LDL诱导的VSMCs MMP-9的蛋白表达上调(P<0．01)。β-actin作为内参。见图3。

图3 平滑肌细胞MMP-9蛋白表达

注：与空白对照组比较，*P<0．05；与Ox-LDL组比较，##P<0．05。

3 讨论

泽泻为泽泻科植物泽泻(Alismaorientalis(Sam．)Juzep．)的干燥块茎，具有利水渗湿、化浊降脂功能。泽泻中含有的主要三萜类成分为泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B及23-乙酰化物等。从泽泻脂溶性部分中分离得到的三萜类化合物被认为是降血脂的有效成分，其中以24-乙酰泽泻醇A作用最强[7]。以往研究主要集中于24-乙酰泽泻醇A的降脂作用,而关于抑制血管平滑肌细胞迁移方面的研究较少。

平滑肌细胞(VSMC)位于血管中膜，是血管中层唯一的细胞成分。生理条件下，VSMC通过收缩和舒张调节血管张力，通过分泌和释放血管调节因子维持血管正常功能。VSMC由中膜迁移到内膜下间隙并异常增殖是动脉粥样硬化、高血压和血管再狭窄等疾病的共同细胞病理基础。而细胞外基质尤其是基底膜为VSMCs迁移必须克服的生理屏障，基质金属蛋白酶是降解VSMCs基底膜基质的主要酶类。MMPs可降解ECM，其中MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)是降解基底膜Ⅳ型胶原最主要的MMPs[8]。曹冠群等[9]研究表明：锌指蛋白A20通过下调MMP-9的表达，抑制Ox-LDL介导VSMCs的迁移作用。研究表明干扰MMP-9基因表达，能有效抑制VSMCs的迁移[10-11]。本实验发现：Ox-LDL组的MMP-9表达水平较空白对照组有所升高，而泽泻醇A(10μg/mL)组MMP-9的mRNA和蛋白表达水平较Ox-LDL组降低，且MMP-9 蛋白表达水平下降较mRNA显著，可能由于MMP-9为分泌型蛋白，除检测细胞内的MMP-9蛋白，细胞培养基中还有分泌型MMP-9蛋白，表明MMP-9表达的增高可能促进血管平滑肌细胞迁移；24-乙酰泽泻醇A可抑制VSMCs迁移，其作用可能与抑制MMP-9的表达相关。

综上所述，24-乙酰泽泻醇A可抑制Ox-LDL诱导的大鼠平滑肌细胞迁移，抑制其MMP-9表达，为24-乙酰泽泻醇A防治动脉粥样硬化提供重要的理论和实践依据。

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(责任编辑：李岚春)

2014-11-21

福建省卫生厅中医药科研项目(WZSY201304)；福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目(2013-ZQN-20-28)；国家自然科学基金项目(81473744)

周晓茂(1988-)，女，福建中医药大学硕士研究生，研究方向为脑血管病的基础和康复研究。

薛偕华(1978-)，男，福建中医药大学附属康复医院副主任医师，研究方向为动脉粥样硬化的基础和临床研究。E-mail：465356738@qq.com

R285.5

A

1673-2197(2015)04-0007-03

10.11954/ytctyy.201504005