兔股骨骨不连模型的建立

张凤鸣

摘要：目的 为治疗骨不连的动物实验研究建立一种客观的实验模型。方法 测量兔股骨中段的直径和矢状径，用于指导模型的制备。制备股骨骨折不连模型，骨折断端用骨蜡封闭髓腔。术后12w经过大体标本观察、影像学及病理组织学检查确定骨不连情况。结果 经过大体观察、组织学及影像学检查均表明骨缺损区为纤维瘢痕组织填充，无骨性连接，断端硬化，髓腔封闭。结论 本实验所建立的兔股骨骨折不连模型，具有骨不连的影像学及病理组织学改变，符合骨不连的要求，是一种实用且可靠的骨不连动物模型。

关键词：骨不连；股骨；缺损长度；动物模型；外固定架

Abstract： Objective To establish an objective animal model for experimental study of treating bone nonunion. Methods The diameter and sagittal diameter of middle rabbit femur were obtained through measurement in order guide the operation. To establish rabbit models of femoral bone nonunion.The bone marrow cavity was sealed by bone-wax.The model of femoral bone nonunion was observed by gross， histological examination and X-ray 12 weeks after the procedure. Results The bone defect was filled by fiber scar tissue，without any bone tissue，and bone end sclerosis was demonstrated by gross，histological and X-ray examination.Conclusion The X-ray and pathological changes of the animal model meet the demands of bone nonunion.The rabbit model of femoral bone nonunion can serve as a reliable experimental model for the study of bone nonunion.

Key words：Bone nonunion；Femoral shaft；Length；Model；External fixation

近年来，骨折治疗水平已经显著提高，但术后仍出现大量的骨折不愈合现象。其发生率为5%～10%[1]。

目前在应用动物实验制作骨折不连模型中绝大部分采用胫骨以及桡骨模型。选用兔的股骨制备骨不连模型的相关研究非常少。 Schmize等根据其所作实验得出结论，造成骨不连的缺损范围为长骨干直径的1.5～2.5倍以上或其长度的1/10以上。张元平等[2] 制备兔股骨中段长15mm缺损的模型，3个月后骨折断端不能愈合，表明此模型具有可行性。参考以上造模过程并以外固定架（Orthofix M103微型外固定架）为固定装置。对实验兔股骨进行解剖后测量其相关数据，并进行统计学分析。最终可以确定制造骨不连模型的骨缺损长度。

1资料与方法

1.1骨不愈合模型的制作：

1.1.1兔股骨指标测量 选取3～6月龄健康新西兰大白兔5只，称重后解剖股骨。应用空气栓塞法将兔处死，用去毛器剃除手术区域兔毛并分离周围软组织，离断髋、膝两关节，获得完整的股骨标本，对股骨长度、横径、矢状径等指标进行测量并记录。

1.1.2选取3～6月龄健康新西兰大白兔20只（由实验动物中心提供），体重为2.75～4kg，雌雄不限。造模前常规饲养7d，待生命体征平稳后进行手术。将3%戊巴比妥钠按照1.0/kg的剂量注入耳缘静脉。实验中视情况可追加麻醉药物。麻醉起效后实验兔取侧卧位于兔台上，保持其呼吸道通畅。应用0.5%碘伏消毒手术区，常规铺无菌手术单。取实验兔大腿中部外侧纵形切口，逐层切开皮肤、皮下组织及深筋膜，于股二头肌与股外侧肌肌间隙钝性分离，充分显露股骨干并保护软组织条件。用尺子在股骨中段测量后并标记，用电钻在股骨干中段标记的两侧骨段钻孔，孔径为1.5mm，间距为5mm，将4枚螺纹针分别固定在缺损两侧骨段，平衡并稳定外固定架。用线锯在股骨中段标记部位垂直截断制成合适长度的骨缺损，手术部位彻底止血后用 0.9%氯化钠注射液冲洗伤口。缝合线依次缝合切口。术后肌注青霉素40万单位，连续1w，1次/d，并用碘伏2次/d消毒伤口预防感染。

1.2大体标本观察 观察股骨干截骨断端骨痂生长情况及骨缺损连接情况。

1.3放射学检查 本研究的影像检查工作均由承德医学院放射科协助完成。术后12w实验兔患肢股骨拍侧位X线片。拍摄条件：距离 80cm、电压50KV、电流强度110mA、曝光时间0.1s。

1.4病理组织学检查 术后12w用空气栓塞的方法处死20只实验兔，取出实验股骨的骨折断端、骨缺损区组织及双侧正常骨组织0.5cm为标本。将标本放入EDTA液脱钙，更换1次/2d脱钙液，15d后停止脱钙。标本取出后用生理盐水清洗表面脱钙液，以 75﹪、80﹪和 90﹪乙醇，无水乙醇Ⅰ和Ⅱ梯度依次脱水15min。后二甲苯溶液透明处理10min。石蜡包埋后用切片机切取厚度为5微米薄片后置于载玻片上，放入 60℃烤箱中30min。脱蜡后将每块切片进行HE染色，经脱水、透明后以中性树胶封片。光学显微镜下观察骨缺损的愈合情况后记录。

2结果

2.1兔股骨干解剖数据测量结果 （平均值） 股骨干长度：94.88mm；直径：6.36mm；矢状径： 5.35mm。（见表1）

2.2一般大体观察 术后第1d生命体征基本平稳，精神状况差伴跛行。1w后生命体征正常，伤口未见化脓等现象。12w后股骨干缺损区未见骨痂包绕，骨端可见大量纤维瘢痕组织覆盖。

2.3放射学检查 骨缺损区无连续性骨痂生长，断端硬化，髓腔封闭，两端有少量骨样组织。

2.4病理组织学检查 光镜下有软骨细胞及骨细胞，细胞呈无序排列，，缺损区为纤维结缔组织。

3讨论

目前对骨不连发生机制的问题尚存在很多争议，治疗起来非常棘手。而建立科学的骨不连模型则是筛选新的治疗方法的基础。国内外学者设计了很多骨不连动物模型，其中有不少研究者将骨缺损模型作为骨不连模型进行实验研究.。

3.1造模动物的选择 选择实验动物需遵循的基本原则为该实验动物与人类的解剖和生理特点较为接近。通过对该种动物的实验研究基本上能重现人类相关疾病的客观规律。并且具有良好的可重复性。近些年，有些学者选用较大的动物如猪、马、牛、羊、猴等动物。但购买这些实验动物的成本高、饲养条件要求高、实验设计难度大而限制了其应用的广泛性。体型较小的动物，虽然具有骨骼小、愈合快、适于细胞学研究的优点，但同样具有不便于骨折固定的缺点[3]。实验研究表明兔的肢体骨与人类较为接近，并具有体形小、易驯服、组织修复较快、繁殖周期较短、饲养管理方便、操作简单、价格低廉、对大样本有利等诸多优点[4]。故本实验研究选择了新西兰大白兔。

3.2兔骨造模部位的选择 此前不连模型主要选择桡骨或胫骨[3]，其原因为尺骨或腓骨有支撑的功能，无需内固定。也因此在制作模型时要去除部分辅助骨及其骨膜[5]。但双骨结构相互代偿对愈合造成干扰。而股骨为单一承重、长度及粗细适合并可避免相邻骨及骨膜干扰，对局部成骨效应也没干扰。兔性成熟后会随个体的增大，骨骼长度及强度进一步增长，故选择3～6个月的兔龄，不会因兔龄过小或股骨干硬度不够影响实验准确性。通过兔股骨的解剖研究证明兔股骨可以用外固定架可靠固定。实体解剖发现股骨外观略成椭圆，其前侧骨面较扁，故采用直径1.5mm固定螺钉。实验中要尽量避免发生骨质劈裂、外固定架脱出等问题以便保证外固定架的稳定。

3.3造模缺损长度的确定 实验中模型的建立存在长度不一等问题，对各项结果的准确性和科学性造成影响。因此，制备一个科学的标准的缺损性骨折不连实验动物模型是实验研究十分重要的一步。

骨缺损是否可以自行愈合首先决定于其缺损长度，此外还包括动物的种属、年龄等。Schmize得出结论，造成骨不愈合的缺损范围为长骨干直径的1.5～2.5倍以上或其长度的1/10以上。一旦骨缺损超过这个长度即超出了骨自行修复的最大能力。国内有些学者曾经制作过长度为15mm的大段骨缺损模型[6]。根据解剖测量得到其直径平均值为5.85mm，根据上述理论可以确定当骨缺损长度为10mm时，骨折不能愈合，可以制成兔股骨缺损性骨不连模型。

参考文献：

[1]Borrelli JJr，Prickett WD， Ricci WM.Treatment of nonunion and osseous defects With bone graft and calcium sulfate[J].Clin Orthop Relat Res，2003，411：245-254.

[2]张元平，崔继秀，裴国献，等.兔股骨缺损模型的建立[J].中国临床康复，2006，10（5）：87- 89.

[3]Murar k.The effect of definitive continuous distraction employed with the type external fixation systemon fracture healing ：an experiment rabbit model[J]. Acta Orthop Traumatol Turc，2005，39：247-257.

[4]李志跃，孙运才.骨基质明胶复合红霉素及同种骨修复节段性骨缺损的实验研究[J].中华骨科杂志，2000，20：（7）440-443.

[5]Robert RS，Weit zman AM， T racey WJ，et al . Simultaneous treatment of tibial bone and soft- tissue defects with the IIizarov method[J].J orthop Trauma，2006，20（3）：197.

[6]彭吾训，王蕾，邓进，等.一种组织工程骨修复兔股骨头坏死模型的效果评价[J].第三军医大学学报，2010，32（7）：661-664.

编辑/康洁