海藻酸钠—聚乙烯醇交联微球制备参数优化研究

王莹　汪航　曾日中　黄茂芳　桂红星

摘 要 采用海藻酸钠和聚乙烯醇为包埋剂，选取交联时间、海藻酸钠和聚乙烯醇用量比（SA ∶ PVA）以及海藻酸钠和聚乙烯醇的总浓度为影响因素设计L49（52×7）正交实验，探讨包埋的最佳理化条件。以包埋材料的成球效果，包埋小球的硬度、弹性及微观结构为考察指标，比较包埋小球性能，探讨包埋条件。结果发现当SA ∶ PVA为7 ∶ 3，总浓度为4%，交联时间为24 h时包埋效果最佳。

关键词 包埋固定化；海藻酸钠；聚乙烯醇；正交实验

中图分类号 X172 文献标识码 A

Optimization of Producting Immobilized Ball by

Sodium Alginate and Polyvinyl Alcohol

WANG Ying1， WANG Hang3， ZENG Rizhong2， HUANG Maofang1， GUI Hongxing1 *

1 Agricultural Product Processing Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，

Zhanjiang， Guangdong 524001， China

2 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737， China

3 College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070， China

Abstract Sodium alginate（SA）-polyvinyl alcohol（PVA）is often used for the immobilization of microorganisms which are used in wastewater treatment system. But previous research often chose treatment efficiency as the main indicator of immobilized condition selection. This study attempts to explore the immobilized condition from the characteristics of immobilized materials. Research by sodium alginate and polyvinyl alcohol as immobilized materials， an orthogonal experiment by three factors with 52×7 levels L49（52×7）was designed to explore the best immobilized condition. The four factors were crosslinking time， the ratio of sodium alginate and PVA（SA ∶ PVA）and the total concentration of sodium alginate and polyvinyl alcohol. Based on the balling effect， hardness and microstructure of the immobilized ball， the results showed that the optimized condition of immobilized was SA ∶ PVA ratio of 7 ∶ 3， the total concentration of 4%， the cross-linking time 24 h.

Key words Immobilize； Sodium alginate； Polyvinyl alcohol； Orthogonal experiment

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.024

包埋法固定化是一种将菌体包埋于各种多孔载体中，使菌体固定化的方法。微生物包埋固定后，可以有效防止微生物流失，增加其局部浓度，以实现反应器快速启动并提高活性和耐冲击性[1]。包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、明胶、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等。有研究结果表明，琼脂强度较差，聚丙烯酰胺凝胶对生物有毒性，明胶内部结构密实，传质性能差[2]。在众多固定化材料中，国内外研究者针对海藻酸钠（SA）和聚乙烯醇（PVA）作为复合包埋材料处理废水的研究应用最为广泛[3]，使用这2种材料混合制作载体，克服了材料各自的缺点，制成的载体材料形状规则，不出现粘连现象[4-5]。SA和PVA复合化学交联后形成互穿网络水凝胶结构，可以保证较高的机械强度[6]。魏大鹏等[7]利用SA-PVA复合材料包埋混合菌剂制成的固定化小球处理养殖废水，24 h氨氮及亚硝态氮的去除率达到96%及98%。马挺等[8]利用SA-PVA共固定化细胞脱除燃料油中的有机硫，总脱硫率达到87.64%，固定化细胞可重复使用5次，使用时间最多可达到250 h以上。大部分研究者集中研究去除效果来优化包埋固定化的条件[7，9-10]，而利用包埋小球本身机械性能作为优化指标的系统研究尚未见报道。本研究选取SA和PVA作为制备包埋材料的基材，以硼酸和CaCl2的混合溶液作交联剂，研究交联时间、SA和PVA用量比以及SA和PVA的总浓度对包埋小球性能的影响，从中找寻规律，为包埋固定化条件的优选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

包埋剂：SA国产化学纯，PVA为进口分装分析纯；交联剂：CaCl2，H3BO3，NaCO3均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 包埋小球的制备 以海藻酸钠和聚乙烯醇作为制备包埋材料的基材，以硼酸和CaCl2的混合溶液（NaCO3调节pH至6.7）作交联剂，机械搅拌混合均匀后，自然滴落成型。

1.2.2 包埋固定化条件优选 选择交联时间、海藻酸钠和聚乙烯醇用量比以及海藻酸钠和聚乙烯醇的总浓度为三因素，设计表1中的L49（52×7）正交实验，对固定化包埋材料的制备参数进行优化。

1.2.3 包埋小球硬度弹性测定 利用Brookfield公司CT3质构仪对固定化材料进行穿刺实验，测定固定化小球的硬度、弹性，夹具底座TA-BT-KIT，探头TA-9型，触发点负载0.07N，测试速度和返回速度均为0.5 mm/s，循环2次，每次刺入深度为3 mm，每种材料测试5个平行样的平均值作为其硬度、弹性。

1.2.4 包埋小球微观结构观察 依次用浓度为30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇，丙酮和乙酸异戊酯，对制备的固定化小球进行溶剂置换，风干。液氮脆断后，选择完整的断面进行喷铂处理，采用日本日立公司生产的S-4800型扫描电子显微镜观察固定化小球的内部微观结构。

1.3 数据分析

对正交实验所得数据利用SPSS13.0进行Kruskal-Wallis秩和检验及主体间效应的检验[11]。

2 结果与分析

2.1 包埋固定化条件优选

正交实验所得结果见表2。具有代表性的成球效果见图1。

因为制作小球初始阶段考察成球效果，所以不考虑交联时间对成球效果的影响，成球效果见表2所示编秩。分别考察因素B及因素C对成球效果是否有影响。结果见表3、4所示。成球效果的数值越大代表成球的效果越好，即Mean Rank（MR）值越大代表该水平的成球效果越好。表3-a中MR6>MR5>MR4>MR7>MR3>MR2>MR1，表明SA：PVA值（B）越大成球效果越好，但是单一SA材料的成球效果还是不如混合材料，成球效果最好的SA ： PVA为9 ： 1。表3-b中P为0.009<0.05，表明不同SA ： PVA水平的成球效果有显著性差异。同样从表4中可以看出，不同SA+PVA总浓度（C）对成球效果有差异（p=0.02<0.05），随着SA+PVA总浓度的上升，成球效果呈现一种先变好再变差的趋势。实验结果显示，当SA+PVA总浓度为0.6%时成球效果最佳。从成球性能来说最佳水平为B6C3，A无影响。

用SPSS13.0软件对硬度和弹性测试结果进行主体间效应的检验，结果见表5。结果显示不同交联时间组对比，硬度和弹性无显著性差异（p硬度=0.197，p弹性=0.505，都大于0.05），交联时间对包埋小球的硬度和弹性没有影响。其他2个因素不同水平组之间硬性和弹性具有显著性差异，p均小于0.05。对正交实验所得硬度值进行极差分析，A，B，C 3因素的R′值分别为0.99，3.32，4.28，R′C> R′B> R′A，所以SA+PVA总浓度（C）对小球硬度的影响最为重要，影响程度的顺序为SA+PVA总浓度（C）>SA ∶ PVA值（B）>交联时间（A），最佳理化条件为A5B7C5。推断增加材料总浓度、交联时间都能增加包埋小球的硬度，在2种材料中，海藻酸钠对硬度影响更加明显；对所得弹性值进行极差分析，A，B，C 3因素的R′值分别为0.62，1.47，1.93，R′C> R′B>R′A，SA+PVA总浓度对小球弹性的影响最为重要，影响程度为SA+PVA总浓度>SA ∶ PVA值>交联时间（A），最佳理化条件A3B5C5。

2.2 微观结构分析

根据成球效果与硬度弹性的分析结果选择A1B4C3，A5B5C3，A4B6C3及A2B5C2的电镜图片进行比较，电镜结果有3种都能形成较好的网络圈套结构，这种结构具有较好的稳定性。同时发现相同SA+PVA总浓度（C）的情况下，SA ∶ PVA值（B）较低时，PVA含量较大（A1B4C3），如图2-a所示，小球结构紧密，但是孔隙率低不利于物质的内外传递，可能会对废水处理效率有影响。当SA ∶ PVA值高时，SA含量较大（A4B6C3），如图2-b所示小球结构松散，强度低，容易破碎，固定化的细菌大部分渗漏使用寿命短。在相同SA ∶ PVA值的情况下，SA+PVA总浓度小（A2B5C2），如图2-d所示，小球的孔隙率大，有较大的比表面积供细菌附着，有利于内外物质传递，且更为经济。所以综合考虑成球效果，包埋小球硬度及弹性，微观结构，实验操作方便（时间选择）。选择的最佳包埋固定化条件为A3B5C2，也就是SA ∶ PVA为7 ∶ 3，总浓度为4%，交联时间为24 h。

3 讨论与结论

SA+PVA总浓度相同时，SA ∶ PVA值（B）越大成球效果越好，但是单一SA材料的成球效果不如混合材料。孙丽慧等[12]发现当SA浓度高，PVA浓度低时，固定化细胞容易成球。随着SA量的增加固定化小球的孔隙率增大，强度也有所增加，但是弹性差，易破碎[13]。PVA浓度太低时固定化小球的机械稳定性较差，而且固定化小球使用后表面易出现破裂和小孔，固定化小球机械强度的损耗很大程度上是由于海藻酸钙受到腐蚀溶解导致的[14]。为实现固定化小球的重复利用，保持较好的机械稳定性，需要综合考虑其他性能决定最佳配比。

不同总浓度（C）对成球效果有差异（p=0.02<0.05），随着SA+PVA总浓度的上升，成球效果呈现一种先变好再变差的趋势，当SA+PVA总浓度为6%时成球效果最佳。SA+PVA总浓度（C）对小球硬度弹性的影响最为重要，影响程度的顺序均为SA+PVA总浓度（C）>SA ∶ PVA值（B）>交联时间（A）。最佳理化条件分别为A5B7C5、A3B5C5。在SA+PVA总浓度较低的情况下，形成的小球结构松散，表面张力不够，表现出不规则形状，而且在搅拌过程中，容易被机械搅拌器破坏；当SA+PVA总浓度适中时，在机械搅拌下易被分散，交联剂加入后，能快速与SA+PVA发生交联反应，使乳滴固化保持现有球形；在SA+PVA总浓度太高，溶液粘度超过一定限度，相同制作条件乳滴趋向更大，与滴嘴的接触面也加大，不易滴落，容易拖尾，交联剂加入后不能及时发生交联反应使微球固化，在搅拌过程中，容易被机械搅拌器破坏形成破损的半球[15]。

小球的硬度与弹性结果显示交联时间对包埋小球机械性能的影响没有显著性差异，赖子尼等[16]同样采用质构仪对海藻酸钠-聚乙烯醇进行硬度的分析，得到交联时间能够较大程度改变凝胶硬度的结果。与本文结果有较大出入，推测原因可能是，赖子尼等人选择交联时间为15～45 min，而本文选择时间为12～36 h，在交联发生的初始阶段混合材料与交联剂的反应时间对材料的硬度有较大影响，而后逐渐减弱，当交联时间达到12 h时，包埋材料已经完全交联，再增加交联时间不会影响包埋小球弹性和硬度，不需要作为主要考虑对象。三因素对小球机械性能影响程度的顺序为SA+PVA总浓度（C）>SA ∶ PVA值（B）>交联时间（A）。最佳理化条件分别为A5B7C5，A3B5C5。随着SA ∶ PVA值的增大弹性呈现先增加后减小的趋势，这也与廖强等[13]所得的结果比较相符，廉哲等[17]也发现随SA含量增加，SA+PVA水凝胶拉伸强度和断裂伸长率均呈现先增加后减小的趋势，且在SA ∶ PVA值为7 ∶ 3时达最大值。

综合考虑成球效果，包埋小球硬度及弹性，微观结构，实验操作方便（时间选择）。选择的最佳包埋固定化条件为A3B5C2，也就是SA ∶ PVA为7 ∶ 3，总浓度为4%，交联时间为24 h。本研究主要以制作完成的包埋小球力学性能及微观结构来探讨包埋条件，为固定化小球的实际使用提供一定的理论基础。对今后力学性能及微观结构的变化还有待进一步研究。

致 谢 杨春亮研究员、余和平研究员和课题组其他成员在实验过程给予的指导或帮助，在此表示感谢！

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