个体乳酸阈标志的有氧能力可训练性相关的尿游离miRNA表达谱特征分析

许英樱 李岩 徐思

摘 要：miRNA参与调控运动性适应基本生理过程的基因选择性表达，其调控模式影响适应能力，导致运动能力可训练性的个体差异。尿游离miRNA（UCFmiRNA）表达谱与组织miRNA密切相关，但不清楚其与运动能力可训练性的具体关联，因而无法用于运动员选材和个性化训练。依据UCFmiRNA表达谱特征与有氧运动能力可训练性水平的关系，构建关联模型用于运动员选材和训练。采用kmeans法对76名男性足球队员14周有氧训练前后个体乳酸阈（ILT）变化率做聚类分析，将研究对象分为对训练的高敏感型组（HR组）和普通敏感型组（CR组）。提取和分析HR组UCFmiRNAs表达谱及模式特征。结果发现：11个在功能上与运动性适应调控相关的UCFmiRNAs构成的特异性表达差异谱与显著高于平均水平的ILT提高率表型有关联，其模式特征与良性运动性适应的生理反应特征一致。得出结论：运动性适应UCFmiRNAs特征性表达谱模式与有氧运动能力的可训练性存在关联并反映其适应生理特点及状态，可用来早期预测有氧运动能力发展潜力、评价训练效果/竞技状态和早期诊断运动伤病。

关键词： 个体乳酸阈；有氧运动能力；尿游离miRNA；可训练性；关联模型；运动性适应；运动员选材；个体化训练

中图分类号： G 811.31 文章编号：1009783X（2015）02017807 文献标志码： A

Abstract：Objective：miRNAs affect the trainability of athletic ability by regulating the essential processes of exercise adaption.The expression profile of Urine cellfree miRNAs （UCFmiRNAs） associates with the pattern of miRNA in tissue，but the specific relation between this profile and the trainability of aerobic athletic ability is unknown.This paper seeks to build the model of UCFmiRNA expressing pattern reflecting the trainability of aerobic athletic ability.Method：76 male soccer athletes are engaged in a 14week aerobic training，and the Individual Lactate Threshold （ILT） before and after the training are measured，and then these athletes are grouped as High Response group （HR group） and Common Response group （CR group），depending on the result of the Kmeans clustering of growth ratio of ILT.The characters of UCFmiRNAs Differential Expression Profile are extracted and analyzed.Result：11 UCFmiRNAs，which are known as closely relating to exercise adoption，and their expressing pattern are extracted，validated，and confirmed to constitute the differential expression profile of HR group which is characteristic of higher growth ratio of ILT，and which Differential Expression Profile coincide with the positive characters of exercise adaption.Conclusion：UCFmiRNAs Differential Expression Profile is closely related to the trainability of aerobic athletic ability，which can be used as a method to forecast the potential of aerobic athletic ability，to value the effect of training，and to diagnose sport hurts early and accurately.

Keywords：individual lactate threshold；aerobic athletic ability；UCFmiRNA；trainability；correlation model；exercise adaption；talent selection；personalized training

杰出的运动能力是具有遗传优势的个体在系统水平对长期训练发生良性适应性重塑的结果[1]。表观遗传学基因调控机制在机体响应环境压力的适应性重塑过程中起到关键作用，其基因调控模式具有个体差别并可稳定遗传，导致适应能力在不同个体间显著不同[2]。适应能力越强，则运动能力的可训练性越好，发展潜力越大[3]。目前，对于表观遗传学基因调控模式与运动能力训练敏感性的具体关联所知甚少，因而无法将其作为指标应用于运动员选材和个性化训练。

microRNA基因表达调控作用是表观遗传学基因调控的主要途径，是环境因素诱导的基因选择性表达的主要调控方式[4]。研究表明，microRNAs分子（以下简称miRNAs）参与了运动性适应基本生理过程的调控，如肌组织肥大[5]、 血管增生[6]、

收稿日期：20141113

作者简介：许英樱（1980—），女，河南洛阳人，硕士，讲师，研究方向为体质健康与运动训练；李岩（1970—），男，山东烟台人，博士，副教授，研究方向为体质健康与运动训练；徐思（1971—），男，吉林长春人，博士，副研究员，研究方向为个体发育、疾病发生与药物治疗的表观遗传学调控模式。

作者单位：1四川师范大学体育学院，四川成都 610101；2鲁东大学体育学院，山东烟台 264025；3四川省医学科学院四川省人民医院，四川成都 610030

1Physical education of Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China；2.Physical education of Ludong University，Yantai 264025，China；3.Sichuan Academy of Medical Sciences &Sichuan Provincial Peoples Hospital，Chengdu 6110030，China.线粒体合成与酶活性提高[7]、心肌/骨骼肌收缩力增强[5]等。miRNAs的表达受转录因子系统和表观遗传修饰等因素的调控，其调控模式本身存在个体差异，形成个体之间环境因素适应能力的差别。miRNA调控模式差别表现为个体之间的miRNA差异表达谱[8]。近期研究证实，尿液游离miRNA（urine cellfree miRNA，以下简称UCFmiRNA）与组织细胞内和循环miRNA表达谱存在密切关联[9]，尿液游离miRNA来源于：1）泌尿系统细胞内miRNA经外泌体排出；2）循环miRNA经血浆滤过作用进入并稳定存在于尿液中，反映机体整体水平的和泌尿系统特异的适应性基因选择性表达调控模式，其作为生物标记在临床早期诊断和判断疾病预后的价值已经得到证实和应用[10]。因此推测：运动性适应过程中UCFmiRNA特异表达谱可作为反映运动能力的可训练性的“分子指纹”，在选材阶段准确预估运动能力的发展潜力，也可以用来评估训练效果，作为制订个性化训练方案的依据。

有氧耐力水平是决定运动能力的主要因素之一[11]，长期周期性训练使机体反复不断地对负荷做出响应和适应，其积累效应为机体适应性重塑和有氧运动能力的提高[12]。个体间表观遗传学调控模式差异使每个周期的适应效果产生差别，最终形成表型水平上的显著个体差异。本研究的设计思路是：以UCFmiRNA作为miRNA调控模式的生物标志，利用一个典型的训练周期获取其“静息—应答—适应”全过程表达谱，分析其与不同训练敏感水平表型之间的关联，从而获得高敏感表型的表观遗传学基因表达调控模式特征。个体乳酸阈（Individual Lactate Threshold，以下简称ILT）能够客观反映具体个体的有氧运动能力[13]，因此，本研究以ILT变化率作为反映有氧运动能力训练敏感性指标设计实验：1）未经系统有氧训练的一组少年男子[年龄为（13.6±0.4）岁]参加为期14周有氧训练，分别于训练前后检测其ILT值，计算ILT的变化率，代表其有氧运动能力的可训练性水平；2）同一研究对象在训练前进行大负荷有氧耐力测试，检测该测试全过程UCFmiRNAs连续表达谱，代表其运动性适应的UCFmiRNA表达谱模式；3）对ILT变化率进行聚类分析，将研究对象分为对训练的高敏感表型和普通敏感表型，分析高敏感表型个体的运动性适应UCFmiRNA表达谱特征，建立运动性适应cmiRNA表达谱与有氧运动能力可训练性的关联模型，作为早期预测有氧运动能力发展潜力和运动性适应特点的指标，用于运动员选材和个性化训练方案制订。

四川省某足球学校学员，76名男生，年龄（13.6±0.4）岁，身高（169.20±6.45）cm，体重（59.68±2.93）kg。既往健康，无伤病史，参加试验前未受过系统的有氧运动能力训练。

1.2 实验方案

训练方案：参加实验学员进行为期14周的系统性有氧运动能力训练。每周一、四16：00～17：30进行5 000 m长跑训练，负荷强度：2～3周60%个人最大心率±3次/min；4～9周65%个人最大心率±3次/min；10～14周75%个人最大心率±3次/min。以Polar表（瑞典产）监控靶心率维持速度（个人最大心率=220-年龄）。训练方案由教练监督执行。

ILT值检测：在训练开始前（第0周）和结束后（第15周）检测ILT值，分别记为基线值和训练值。

UCFmiRNAs表达值测定：训练第1周第1天训练前清晨空腹安静状态下测试UCFmiRNAs基线表达值，第3天完成12 min跑测试后1 h内、恢复24 h和48 h检测UCFmiRNAs表达值，分别记为测试后0 h表达值、24 h和48 h恢复表达值。具体安排见表1。

1.3 分组和分析方法

1.3.1 计算14周训练后ILT相对于基线值的变化率

ILT变化率=[（训练值-基线值）/基线值]×100%

1.3.2 聚类分析和分组

对ILT变化率数值进行kmean聚类分析，根据聚类分析结果将学员分为对有氧运动能力训练的高敏感型组（high response group，以下简称HR组）和普通敏感型组（common response group，以下简称CR组）。

1.3.3 HR组UCFmiRNAs特征性表达谱分析

1.3.3.1 获得UCFmiRNAs表达谱后，参照文献选取其中与运动性适应相关的miRNAs，qRTPCR验证并计算各组以下指标：1）基线表达值；2）训练后0 h表达值；3）24 h恢复表达值；4）48 h恢复表达值相对于基线表达值的变化比率，以相对于基线表达值比率升高或降低超过2倍为显著性差异表达（基线表达值相对比率为1），以显著性差异表达的UCFmiRNAs构成有氧运动能力训练相关UCFmiRNA表达谱。比较HR组和CR组UCFmiRNAs表达谱，提取HR组的UCFmiRNAs特征性表达谱。

1.3.3.2 UCFmiRNA特征性表达谱与ILT关联模型miRNA入选标准

1）microRNA芯片检测结果与qRTPCR验证结果一致。

2）UCFmiRNA的基线表达值在HR组和CR组之间无显著性差异（±10%以内）。

3）文献显示该miRNA与运动性适应相关的生理过程存在关联。

表 1 实验测试及训练安排

1.4 指标检测方法

1.4.1 ILT测定

采用递增负荷法测定ILT，功率自行车（瑞典产Monark894E、839E）起始负荷为50 W，每2 min递增40 W，转速维持在50 r/min，直至力竭（力竭标准：连续2次不能维持规定转速），测试过程中鼓励受试者使其尽可能坚持5个负荷级别。血乳酸值测定：取中指指尖血20 μL，采用YSI1500便携式血乳酸自动分析仪测定血乳酸值。分别采取安静状态下、每级负荷后即刻及恢复期第2、5、8、10、15 min血样。测试结果记录在表中，采用Stegmann方法判定ILT[14]。

1.4.2 miRNAs microarray检测尿液UCFmiRNAs并用qRTPCR验证

1.4.2.1 miRNAs microarray检测尿液UCFmiRNAs

尿样采集和处理：见表1：分别于第1周第1天清晨空腹安静状态下、第3天12 min跑测试结束后1 h内、恢复24 h和48 h后安静状态接取中段尿100 mL，离心，取上清，冻干法浓缩至25 mL，参照文献方法[15]，每份样本加入miRNA422b mimic（终浓度为2×105 mmol/L）作为质控标记。放入-80 ℃冰箱保存，备用。

总RNA提取和MicroRNA芯片测定UmiRNAs表达谱：采用miRCURY RNA isolation kit（EX300112 Exiqon）提取small RNA（2。

1.4.2.2 UCFmiRNA实时定量RTPCR（qRTPCR）

尿液miRNA使用mirVana TM Pairs miRNA isolation kit（Ambion）试剂盒抽提，miRNA的提取参照试剂盒的使用说明书进行。以10 ng总RNA为模板合成cDNA，使用MMLV反转录酶试剂盒（Thermo），利用设计合成的特异性反转录引物进行反转录反应（引物序列见表2），条件为16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

BioRad iCycler PCR System进行qRTPCR检测[Real Master Mix（SYBR Green）等PCR相关产品均购自天根生化科技有限公司]。Real Time PCR反应程序：95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，40循环；以上循环结束后进行65～95 ℃的融解曲线分析。为确保实验数据的有效性，每个样品平行3次，溶解曲线为单一峰（扩增曲线和溶解曲线见图1）。PCR完成后经电脑分析，查看每个miRNA的扩增情况，导出相应的域值循环数CT值，以U6作为相对定量的内参。目的基因的相对表达 （relative expression，RQ） 采用△△CT方法计算，2△△CT为目的基因的相对表达强度。

表 2 UCFmiRNAs反转录引物和qRTPCR检测引物序列

表 2（续）

图 1 A为cmiRNAs扩增曲线；B为cmiRNAs熔解曲线

1.5 数据处理与分析

采用SPSS 17.0软件对结果进行处理。各项数据均采用表示，均数间比较采用两独立样本的t检验分析，P<0.05表示2组间的差异有统计学意义。

2 研究结果

2.1 ILT测定结果

参训学员ILT基线值和训练值见表3。

表 3 参训学员14周训练前后ILT水平（X±S）

2.2 对ILT变化率进行聚类分析结果

kmean法对参训学员14周训练后ILT相对于基线值变化百分率进行聚类分析，将实验对象分为HR组和CR组，聚类结果如图2所示。聚类中心分别为36%和21%。比较2组间ILT变化率，HR组显著高于CR组（P<0.05），具体结果见表4。

2.3 HR组UCFmiRNA特征性表达谱

与CR组表达水平相比较，HR组有显著性差异的UCFmiRNAs有25条，其中上调14条，下调或保持平稳11条。查询文献获得功能与运动性适应有关的miRNAs并经qRTPCR确认表达模式与基因芯片结果一致为11条，其中6条以上调为主要特征，5条以平稳或下调为主要特征。UCRmiRNAs名称及功能见表5和表6，cmiRNAs表达模式特征分别如图3（上调）和图4（下调或保持平稳）所示。图3中，以静息状态cmiRNAs表达水平的相对值为1，HR组与CR组相比较表达模式以显著上调为主要变化趋势的miRNAs表达特征如下：1）HR组miR29b、451、222、181、26a表现为训练后0 h显著上调，24 h回调至静息水平，48 h保持平稳。2）CR组miR192在0 h显著上调，24 h在高水平保持平稳48 h继续上调；其余miRNAs表达水平均在静息值左右波动，无显著性改变。图4中，以静息状态cmiRNAs表达水平的相对值为1，HR组与CR组相比较表达模式以平稳和显著下调为主要变化趋势的miRNAs表达特征如下：1）CR组miR133、328、146a表现为训练后0 h显著上调，24 h开始回调，48 h继续回调，趋向平稳；miR155表现为训练后0 h显著上调，24 h继续上调，48 h回调。2）HR组miR133、328、146a表达水平均在静息值左右波动，无显著性改变；miR155在24 h显著下调，48 h小幅回调；miR192在0 h上调，24 h回调，48 h趋向平稳。

图 2 kmean法对参训学员14周训练后ILT

相对于基线值变化百分率聚类分析结果3 讨论

本研究探讨有氧训练的运动性适应过程中UCFmiRNA表达谱与有氧运动能力可训练性之间的关联。研究发现，具有显著高于普通水平的ILT变化率表型的个体在运动性适应过程中有11个UCFmiRNA显示出明显特征性的表达模式。文献表明，该组UCFmiRNA参与调控运动性适应的基本生理过程。本研究结果表明，一组特定的UCFmiRNA的特征性表达谱与有氧运动能力的可训练性水平具有显著的关联性，可用来建立关联模型对其加以鉴别和评估。本研究结果提示，运动性适应能力与miRNA调控基因选择性表达的模式有关，杰出运动能力表型的可训练性水平可以通过特征性UCFmiRNA表达谱加以分辨和评估。可以利用特征性的UCFmiRNA表达谱在有氧能力发展敏感期准确预测其发展潜力，在早期将具有相关运动天赋的运动员选拔出来加以系统培养，或用以评估运动员的训练适应状态，调整训练计划，预防和早期诊断运动伤病。

遗传因素决定了个体运动能力的上限及其训练敏感性，但迄今为止还没有发现经典遗传学意义上决定运动能力的主控基因；因此仍不清楚是什么遗传因素决定了具体个体的运动能力及其训练敏感性，而如何早期准确预测和评估个体运动能力的发展潜力仍然是运动选材和训练的基本问题[24]。机体在训练压力的适应过程中发生基因选择性表达，表观遗传学调控机制决定了基因表达的选择性和表达效率，通过DNA甲基化、组蛋白共价修饰、RNA编辑等机制对环境因素做出响应和适应，miRNAs编辑作用是表观遗传学基因调控的重要途径，可能是运动能力及其训练敏感性个体差异主要原因。近期研究证实，miRNAs在运动适应性应答过程中发挥了重要调控作用[25]。miRNAs的表达受表观遗传学控制，使基因调控方式本身存在类型差别，影响个体训练敏感性和运动能力的发展潜力[26]。miRNA调控模式反映在其表达谱上，并与UCFmiRNA存在密切关联[10]，通过检测UCFmiRNAs表达谱鉴别miRNA基因调控模式，使研究者有可能在运动员选材和训练中准确预测和评估运动员对训练负荷的适应能力。本研究在以下方面对UCFmiRNA在运动训练中的应用进行了新的探索：1）本研究首次以尿液UCFmiRNA表达谱作为生物标记鉴别与分析有氧运动能力可训练性的表观遗传学调控模式。尿液内UCFmiRNA与细胞miRNA和游离miRNA表达谱存在密切关联，作为病理学生物标记已经应用于临床疾病诊断和预后。大强度运动后肾脏滤过机能改变使尿UCFmiRNA在成分和表达水平上与循环miRNA接近，同时，泌尿系统组织特异性的miRNA表达谱也会随机体生理病理状态变化而发生改变，因而可以作为反映运动性适应过程中miRNA调控模式类型和适应状态的生物标记。2）本研究建立了UCFmiRNA与有氧能力训练敏感性的关联模型和一种简便易行的无创检测方案，可以用于早期评估有氧运动能力的发展潜力和训练适应状态。

关于UCFmiRNA的表达行为机理及其与组织miRNA和循环miRNA的确切关系，目前尚不清楚，因此，对于运动性适应的miRNA基因调控机理探讨超出了本研究范围；但在此仍可以对于UCFmiRNA表达特征所反映的运动性适应状态做一定的分析。首先，运动后即刻（0 h）肾脏滤过功能减弱，此时的UCFmiRNA表达谱与循环miRNA表达谱十分接近，因此可以通过其0 h表达谱分析训练诱导的运动性适应机理和miRNA调控模式特征。运动性适应过程中，miRNAs调控基因选择性表达，其作用机理是通过与靶基因mRNA3UTR结合促进其降解或抑制翻译引起衰减效应，此外，还通过翻译起始抑制，翻译起始后抑制，P小体（processing body）、应激颗粒（stress granule）扣押靶mRNA、去抑制和激活等作用调节基因选择性表达[27]。体能训练的实质是运动应激，诱导机体做出响应。在训练过程中，血液重新分布引起局部缺氧和代谢物堆积，血液循环速度加快引起红细胞机械损伤，心肺系统工作负荷增加导致心肌、骨骼肌、血管/呼吸道管腔壁机械应力增加，能量快速消耗引起代谢系统工作状态改变，代谢加速导致自由基水平迅速上升，增加氧化应激损害，持续性大强度运动引起疲劳和免疫机能抑制等。miRNAs调控基因选择性表达使机体发生肌组织肥大、血管增生、线粒体合成与酶活性提高、心肌/骨骼肌收缩力增强等适应性表型[27]。分析0 h UCFmiRNAs表达谱特征可见：1）与CR组相比，HR组在以下适应性反应方面具有更强的调控反应：①心肌、骨骼肌、血管/呼吸道管腔壁平滑肌对应力变化的响应，以及肌组织肥大、弹性增强和肌纤维类型转换（miR21[18]、miR451[17]、miR181[19]、miR26a[20]、miR222[15]）；②线粒体代谢能力增强（miR181[19]）；③心肌、骨骼肌对胰岛素的敏感性增强，糖代谢水平提高（miR29b[16]）；④促红细胞生成作用（miR451[17]）。同时，肌肉特异性miRNA（miR133[21]）水平保持稳定，说明HR组未出现明显的肌损伤；miR146a[15]平稳、miR155[22]下调表明HR组未出现运动性免疫抑制，表明其疲劳耐受能力强。2）从UCFmiRNA表达谱整体特征可以看出，在24 h到48 h，各个UCFmiRNA均恢复至静息水平，表明HR组肾脏功能状态恢复显著好于CR组，反映出HR组对于运动性疲劳具有更好的耐受性和更强的恢复能力。3）miR192[23]是肾组织特异表达的miRNA，与肾功能和尿蛋白水平平行的相关性[28]，而尿蛋白水平与运动性疲劳耐受及恢复关系密切[29]。与CR组比较，HR组miR192表达水平更快地恢复到静息状态并保持稳定，表明其肾脏功能迅速恢复正常水平，因此可以推断HR组对疲劳耐受力更强、恢复更快、适应状态更好。尽管目前还不了解UCFmiRNAs的表达水平变化在运动性适应过程中的确切含义，但根据已有研究对miRNA功能的认识，HR组UCFmiRNAs特征表达谱显示的运动性适应有关的代谢调控特征符合研究者对优秀运动员的训练适应特点的经验性了解。说明UCFmiRNA表达特征与运动性适应之间存在本质上的一致性。

本研究的发现为miRNAs在运动训练领域的进一步深入研究提供了重要的依据。首先，miRNAs是18～22 nt的短链分子，主要作用机理是通过与靶基因mRNA 3UTR结合调节其表达效率。目前已知的很多与运动能力表型相关的基因多态性突变均发生于3段序列，单个碱基的突变就可以明显影响miRNAs与靶基因的结合效率；因此，miRNAs很有可能是基因多态性影响运动表型的重要调控途径之一，进一步的研究将以此为线索展开。其次，UCFmiRNAs是一种无创检测的表观遗传学基因调控方式，其表达特征与适应过程的基本环节密切关联，反映了机体对运动训练的适应能力，与远期训练效果有着密切关联，因而可以作为生物标记应用于运动员选材。第三，UCFmiRNAs反映了机体对负荷的适应状态、耐受程度、疲劳程度及恢复情况，因而可以作为监控指标应用于运动训练。最后，UCFmiRNAs表达特征与运动伤病存在直接的关联，可以作为早期诊断指标应用于运动伤病的诊断和治疗。

本研究的局限：1）本研究在研究对象的性别、数量、所处的敏感期、训练方式和运动水平等方面都存在局限性，所以，尽管本研究对UCFmiRNAs表达特征与有氧能力关联的可训练性做出了一定程度的说明；但所得到的UCFmiRNAs表达谱对与运动员选材和训练的应用价值还需要进一步的验证和补充。2）尿液中游离miRNA含量较低，直接采用miRNAarray不易检测，浓缩方法虽然不影响miRNA的稳定性；但对分析结果的干扰仍需进一步研究，同时在检测方法学上仍需作进一步的论证方可大范围应用于运动训练实践工作。3）UCFmiRNAs表达谱在运动型适应过程中的确切含义及其与组织miRNA和其他体液miRNA表达谱之间的关联关系仍有待深入研究，目前无法对结果进行深入的功能性解读，本研究结果目前只能停留在生物标记应用水平。

4 结论

综上所述，本研究发现典型有氧训练周期的运动性适应过程中UCFmiRNAs表达谱与有氧运动能力的可训练性之间存在密切的联系，并初步建立关联模型，同时也提出一种采用表观遗传学指标进行运动员选材和指导训练的方法，以UCFmiRNAs表达特征作为生物标记评估运动能力的发展潜力和训练适应状态。进一步的研究将对UCFmiRNAs特征表达谱在运动员选材、训练效果/比赛状态评估以及运动伤病的诊断治疗等方面的应用价值做出更为全面和深入的探索。

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