降香黄檀—檀香根际土壤高效解磷细菌的分离筛选与鉴定

徐睿　刘君昂　周国英　李冬琴　罗娜　黄馨

中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南长沙 410004

摘 要 利用PKO无机磷培养基从不同林龄的降香黄檀-檀香根际土壤中分离筛选高效解磷菌，为进一步研制专用生物复合肥提供依据。通过溶磷圈法筛选溶磷较强（D/d值大于1.5）的菌株19株，采用钼锑钪比色法测定其解磷能力。结果显示：菌株无机磷溶量在9.23～223.27 μg/mL之间，3株菌无机磷溶量在170 μg/mL以上；菌株有机磷溶量在0.43～25.05 μg/mL之间，有机磷溶量在15 μg/mL以上有4株。采用Salkowski 比色法测定菌株分泌IAA能力，10株菌具有分泌能力，其中DosaP25分泌IAA量达32.14 μg/mL。综上所述，菌株DosaP15、DosaP25具有较强的解磷、分泌IAA能力。基于形态学、生理生化特性及16 S rDNA序列比较分析，初步鉴定DosaP15属于Bacillus pumilus、DosaP25属于Bacillus subtilis。试验同时表明，菌株溶磷量、分泌IAA量与培养液pH值之间不存在显著相关性。

关键词 降香黄檀；檀香；根际解磷菌；解磷能力；IAA

中图分类号 S182 文献标识码 A

磷是植物生长发育的必需元素且主要从土壤中获取，而土壤中绝大部分磷以难溶状态存在，不利于植物吸收，成为限制植物生长发育的重要因素[1-2]。有研究发现，土壤中存在着将植物难以吸收的难溶态磷转化成有效态磷的微生物，称其为解磷菌或溶磷菌[3]。甚至部分解磷菌还能分泌促生物质，改善植物根际土壤环境，促进植物生长[4-5]。乔志伟等[6]从石灰性土壤作物根际分离溶磷细菌，其中W25对磷酸三钙的溶解能力达385.5 mg/L，同时可分泌甲酸、乙酸、草酸、琥珀酸等多种有机酸。

降香黄檀（Dalbergia odorifera）为豆科蝶形花科半落叶乔木，国家II级重点保护野生植物[7]；檀香（Sandalwood）为半寄生性常绿乔木，须与寄主共生才能存活[8]。两者均为珍贵红木用材树种，心材坚硬、耐湿耐腐，是制作名贵木制品的重要原料，具有重要的药用价值[9-10]。然而降香黄檀、檀香生长缓慢，通常数十年才能成材，人为盗伐严重，野生资源已濒临灭绝。近年来，通过对降香黄檀、檀香的大规模推广种植，以推动贫困地区致富，同时对降香黄檀、檀香种质资源起到有效的保护。其中以降香黄檀-檀香混交模式种植，效果较好。檀香抑制降香黄檀快速增高有利于其心材的形成，降香黄檀为檀香提供营养物质促进檀香生长[11-12]。但降香黄檀、檀香幼苗（幼林）长势差、生长缓慢等问题未得到有效解决，同时大量化肥的施用引起了环境污染、生产成本增加等问题。本文旨在从降香黄檀、檀香根际土壤中筛选出高效解磷菌，研究其解磷、分泌IAA等特性，为专用生物复合肥研制提供理论基础，以解决降香黄檀、檀香幼苗（幼林）长势差、生长缓慢等问题，到达减少化肥施用量、降低生产成本的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样采集 在海南省降香黄檀、檀香种植区（澄迈、定安、尖峰、东方、白沙等地），利用五点随机采样法，采集3、4、5、6、7、10年生的降香黄檀、檀香根际土壤（20～40 cm），装入保鲜袋（无菌）中，冷冻保存带回实验室分离。

1.1.2 供试培养基 PKO无机磷培养基、蒙金娜有机磷细菌培养基、King氏培养基、LB培养基等[13]。

1.2 方法

1.2.1 根际高效解磷细菌的分离 称取样品10 g（不同林龄的降香黄檀、檀香土样），置入装有90 mL无菌水的三角瓶中，振荡20 min，制成土壤悬液。采用10倍稀释法配制浓度梯度为10-4、10-5、10-6的土壤悬液样品，用于解磷细菌的分离。每个浓度梯度吸取100 uL涂布于PKO无机磷固体培养基上，重复3次，恒温28 ℃培养2～4 d。挑选长势较好的单菌落，做好标记后选用LB固体培养基进行纯化，4 ℃保存。

1.2.2 菌株解磷能力测定 定性测定：将分离纯化后的培养物采用PKO无机磷固体培养基、恒温28 ℃培养4 d，记录D/d（溶磷圈直径/菌落直径）值，筛选D/d 值较大的菌株，用LB培养基斜面保存。

定量测定：在250 mL三角瓶中加入灭菌的100 mL PKO无机磷液体培养基或蒙金娜有机磷液体培养基，取1 mL待测菌株菌悬液（108 cfu/mL）分别加入到250 mL三角瓶中，160 r/min，恒温30 ℃培养7 d，测定培养介质pH值；对照组用1 mL无菌水替换1 mL菌液，其余条件不变。将培养液4 ℃，10 000 r/min离心10 min，取上清液。采用钼锑抗比色法测定上清液OD700 nm值，根据标准曲线计算菌株的无机磷（有机磷）溶量[14]。

1.2.3 菌株分泌IAA能力测定 用分光光度计，采用Salkowski比色法[15]测定波长530 nm的OD值，根据标准曲线换算出IAA分泌量，并各测定各菌液的环境pH值。

1.2.4 菌株鉴定 菌株形态观察：记录待鉴定菌株在蒙金娜有机磷固体培养基上培养2 d的菌落特征，用显微镜观察菌体形态特征。

生理生化：参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）及《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠编），进行细菌生理生化试验。

16 S rRNA序列测定及分析：以提取的待测细菌菌株基因组DNA为模板，选用细菌16 S rRNA基因通用引物27F和1492R，进行PCR扩增。PCR反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30个，72 ℃ 10 min。将所得产物样品送至上海博尚生物技术公司测序，测序结果在NCBI中进行BLAST分析，利用EGA5.05软件，使用Neighbor-Joining法进行计算分析（Bootstraps=1 000），构建菌株系统进化树。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0进行方差分析和多重比较（LSD法和Duncan检验），并用Excel 2010制作图表。

2 结果与分析

2.1 根际高效解磷细菌的分离、筛选

2.1.1 解磷细菌的分离纯化 利用PKO无机磷培养基，从不同林龄（3、4、5、6、7、10 a）的降香黄檀、檀香根际土壤，分离纯化出可培养物187个。菌落呈近圆形或椭圆形、白色或黄色、半透明或不透明、大部分表面扁平、边缘规则、生长速度中等。

2.1.2 菌株解磷能力定性测定 利用溶磷圈法在PKO无机磷固体培养基上培养4 d，测定各菌株溶解磷酸钙能力，筛选出D/d值大于1.5的菌株共计19株（图1）。其中9株菌株的D/d值在1.5～2.0之间，占测定菌株的47.36%；D/d值在2.0～2.5间的菌株有6株，占测定总数的31.58%；有4株的D/d值大于2.5，占测定总数的21.05%。溶解磷酸钙能力较强菌株是DosaP25，D/d值达到4.1；其次是DosaP7，D/d值为3.23。

2.1.3 菌株解磷能力定量测定 各菌株溶解无机磷（磷酸钙）的量在9.23～223.27 μg/mL之间（表1），其中3株菌的无机磷溶量在170 μg/mL以上，占供试菌株的15.79%。DosaP25溶解磷酸钙的量高达223.27 μg/mL，其次是DosaP15和DosaP23，分别达196.47、174.32 μg/mL。无机磷溶量在20～100 μg/mL间的菌株有9株，占供试总数的47.37%；5株菌株的无机磷溶量在20 μg/mL以下，占供试总数的26.32%。除菌株DosaP2与DosaP10间无显著差异外，其它菌株间均达到显著差异（p<0.05）。DosaP25的溶解无机磷能力是DosaP5（9.23 μg/mL）的24.19倍，是对照组（4.55 μg/mL）的49.07倍。

同时测定各菌株对有机磷（卵磷脂）的溶解能力，供试菌株对卵磷脂的溶解量在0.43～25.05 μg/mL之间。有机磷溶量在10 μg/mL以下的菌株有13株，占供试总数的68.42%；5株菌株的有机磷溶量在10～20 μg/mL之间，占供试总数的26.32%；其中DosaP15溶解卵磷脂的能力最强，达到25.05 μg/mL，其次是DosaP25（19.22 μg/mL）。菌株DosaP3与DosaP9、DosaP4与DosaP16之间卵磷脂溶解量无显著差异，其余菌株之间差异显著（p<0.05）。DosaP15、DosaP25溶解有机磷的能力分别是DosaP5的58.26、44.70倍。

2.1.4 菌株解磷能力与终点pH值间关系 PKO无机磷、蒙金娜有机磷液体培养基的起始pH值均为7.2，各菌株PKO无机磷培养液终点pH值的测定结果显示：终点pH值偏酸且随着磷酸钙溶解量的增加呈下降趋势，对照组的pH值在7.0附近略微变化（图2）。DosaP15溶解磷酸钙的量达223.27 μg/mL，对应的培养液终点pH值为5.62。17株菌株的培养液终点pH值在6.0～7.0之间，占供试菌株的89.47%。菌株对磷酸钙的溶解量与培养液终点pH值之间不存在显著的线性回归关系，R2（相关系数）仅为0.850 6。

各菌株蒙金娜有机磷培养液终点pH值的测定结果表明：与磷酸钙的溶解量相比，随着卵磷脂溶解量的增加，终点pH值的下降趋势更加明显（图3）。6株菌株的培养液终点pH值在5.23～6.0之间，占供试菌株总数的31.58%；菌株DosaP15溶解卵磷脂的量最大，其培养液终点pH值（5.23）下降明显；对照组的pH值无明显变化。菌株溶解卵磷脂的量与终点pH值之间的相关系数为0.536，表明两者之间无显著线性回归关系。

菌株的PKO无机磷、蒙金娜有机磷培养液终点pH值绝大部分集中在6.5左右，而对照组的起始pH值与终点pH值均在7.0左右。这些说明解磷细菌分泌一些酸性物质，使得H+数量增加导致pH值下降。DosaP5的终点pH值（6.13）低于DosaP14（6.15），但DosaP14的卵磷脂溶量（4.35 μg/mL）远高于DosaP5（0.43 μg/mL）。表明，解磷细菌溶解磷的能力不完全取决于培养介质中H+的数量。

2.1.5 菌株分泌IAA能力测定 结果显示（表2），10株菌株具有分泌IAA能力，占供试总数的52.63%；分泌IAA量在25 μg/mL以上的菌株有3株，即DosaP25（32.14 μg/mL）、DosaP23（28.7 μg/mL）、DosaP15（27.53 μg/mL）。各菌株之间分泌IAA能力差异显著，其中DosaP25（32.14 μg/mL）分泌IAA量是DosaP5（4.56 μg/mL）的7.05倍。

King氏液体培养基的起始pH值为7.2，各菌株分泌IAA量与培养液终点pH值之间的相关系数R2为0.944，表明菌株分泌IAA量与终点pH值之间无显著的线性回归关系（图4）。随着菌株分泌IAA量的增加，培养液终点pH值呈下降趋势；无分泌IAA能力菌株培养介质终点pH值偏中性或碱性，说明菌株分泌IAA导致培养介质中H+数量增加从而引起pH值下降。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 菌株形态学观察 挑选有机磷溶量在19.0 μg/mL、无机磷溶量在190.0 μg/mL、分泌IAA能力在27.0 μg/mL以上的菌株DosaP15、DosaP25进行形态学观察。

在蒙金娜有机磷固体培养基上培养2 d，DosaP15菌落呈污白色，近圆形、半透明或不透明、表面光滑、边缘整齐、生长较慢；DosaP25菌落呈淡黄色，近圆形、不透明、表面光滑、中间隆起、边缘整齐，生长较快（图5）。

DosaP15革兰氏染色阳性，细杆状，单个或成对排列，大小为（2.2～2.8）μm×（0.6～0.7）μm，产芽孢；DosaP25革兰氏染色阳性，杆状，两端钝圆，多个排列时成短链，大小为（2.2～3.0）μm×（0.7～0.8）μm，产芽孢（图6）。

2.2.2 菌株生理生化实验 DosaP15、DosaP25的主要生理生化指标试验结果表明（表3）， 两者相同点在于运动性试验、V.P试验、过氧化氢试验为阳性，不产气，可利用葡萄糖、果糖、柠檬酸盐，液化明胶；在2% NaCl、5% NaCl中均可生长，5 ℃不生长，耐受温度为41 ℃，产芽孢。不同点在于DosaP15 甲基红试验为阳性，不能利用乳糖，不可水解淀粉，硫化氢、硝酸盐还原试验阴性；DosaP25甲基红试验为阴性，可利用乳糖，水解淀粉，硝酸盐还原、硫化氢试验阳性。结合形态学特征和生理生化指标，初步判断DosaP15、DosaP25属于芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。

2.2.3 16 S rRNA基因序列测定及分析 将待鉴定菌株16 S rRNA基因测序所得序列，采用BLAST进行同源性比较，与GenBank中的核酸数据对比分析，DosaP15与Bacillus pumilus（JX 102495）同源性达99%，DosaP25与Bacillus subtilis（KF 831377）同源性达99%。选取同源性较高的代表菌株，以16 S rRNA基因序列为基础，构建系统发育树（图7、8）。相比芽孢杆菌属的其它种，DosaP15与短小芽孢杆菌的遗传进化距离最近，同处一个最小分支；DosaP25与枯草芽孢杆菌的遗传进化距离最近，同处一个最小分支。将DosaP15、DosaP25的形态特征、生理生化测定指标与表4[16-17]进行对比，发现DosaP15、DosaP25的主要特征分别与短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌相一致。结合16 S rRNA序列分析，初步鉴定DosaP15为短小芽孢杆菌、DosaP25为枯草芽孢杆菌。

3 讨论与结论

土壤中磷素循环以微生物活动为中心，微生物活动对土壤磷素的转化影响很大。土壤微生物在植物根系区间的生态分布数量远高于非根系土壤区间。植物的代谢物质通过根系进入土壤中，不仅能作为微生物繁殖的营养物质，甚至对一些菌群的生长起到刺激作用。Kabznelson等[18]和赵小蓉等[19]研究发现，解磷菌在植物根际土壤中的分布数量比非根际土多出1～2个数量级。

溶磷圈法只能作为初筛解磷微生物的方法，D/d值不能完全反应菌株的溶磷量。本研究中，溶磷圈法初筛的D/d值DosaP15（1.89）小于DosaP23（3.0），而DosaP15的无机磷溶量（196.47 μg/mL）、有机磷溶量（25.05 μg/mL）均高于DosaP23（174.32、19.22 μg/mL）。Kucey等[20]研究也证实了溶磷圈法只能用于初筛解磷菌。另外，不同根际解磷菌株的解磷能力存在较大差异，DosaP25溶解磷酸钙的量（223.27 μg/mL）是DosaP5（9.23 μg/mL）的24.19倍，DosaP15、DosaP25溶解卵磷脂的量（25.05、19.22 μg/mL）分别是DosaP5（0.43 μg/mL）的58.26、44.70倍。这可能与植物所处的土壤类型、土壤肥力、气候及植物的年龄、长势等综合因素有关。林启美等[21]研究证实了不同土壤生态环境中解磷菌分布存在较大差异，菜地土壤中有机磷细菌数量是林地、草地、农田的10倍。

对于解磷菌的解磷机理，尚未有一个准确的定论，不同菌株的解磷机理有所差别。在土壤无机磷缺乏的情况下，解磷菌通过分泌核酸酶、磷酸酶及植酸酶等，溶解有机磷转化成无机磷酸盐的形式。一般认为，解磷菌溶解无机磷与自身分泌酸性物质有关，这些物质可降低pH值，能与Al3+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Fe2+等离子结合，从而溶解难溶性磷酸盐。不同解磷菌株分泌有机酸的种类存在较大差别，如席琳乔等[22]从棉花根际分离出的解磷菌可分泌酒石酸、乙酸、柠檬酸、丁二酸，而朱颖[23]从三叶草根际土壤中分离的解磷菌可产草酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸。一些解磷菌还可分泌植物激素IAA且不同菌株分泌IAA量存在明显差异。如DosaP25分泌IAA量是DosaP5的7.05倍；李显刚等[24]从百脉根根际土壤筛选出11株具有分泌IAA能力的溶磷菌，其中菌株LC20分泌IAA能力是LC5的4.62倍。本研究中菌株的解磷能力、分泌IAA能力与培养介质终点pH均无显著相关性，各菌株培养介质终点pH与起始pH相比呈下降趋势，对照组的培养介质pH无明显变化呈中性或略偏碱性。与赵小蓉等[25]研究发现解磷菌的溶磷量与培养介质pH值及有机酸分泌量均无显著相关性的结果相近。菌株的磷酸钙溶量、卵磷脂溶量、IAA分泌量与培养介质终点pH之间的相关系数存在如下关系，R32（0.944）>R12（0.8506）>R22（0.536）。说明IAA分泌量与培养介质终点pH之间的关系更为密切，证实了解磷细菌通过分泌一些酸性物质，使得质子数量增加导致pH值下降。下一步将对筛选出的高效解磷菌作进一步研究，以用于专用生物复合肥的研制。

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