瓜菜类植物花粉超低温保存研究进展

刘 林 曹春信 刘新华

摘要：超低温保存是指在-80℃～-196℃甚至更低温度下保存生物材料的一种方法。花粉包含物种的所有基因类型，作为植物种质的重要形式，是种质保存和交换以及杂交育种的重要材料。花粉超低温保存广泛应川于瓜菜、农作物、果树、药用植物及园林植物等各类植物：花粉超低温保存能大大延长花粉的保存时问，为种质交换提供便利，同时能解决育种中花期不遇或异地授粉等问题，提高育种效率。阐述了花粉超低温保存的技术流程，对花粉保存效果的评价方法进行了总结，探讨了超低温保存的遗传稳定性，同时介绍了超低温保存机理的研究进展，以期为进一步研究瓜菜类植物花粉超低温保存提供参考。

关键词：瓜菜类植物；种质资源；花粉；超低温保存

花粉是植物种质的重要形式之一，它包含该物种的所有基因类型，是种质保存和交换以及杂交育种的重要材料。在育种或制种过程中常常遇到亲本花期不遇或异地授粉，如能提前保存花粉，延长花粉寿命，无疑能很好地克服这一困难。

超低温保存是指在-80℃（干冰温度）～-196℃（液氮温度）甚至更低温度下保存生物材料的一种力‘法超低温保存一般以液氮为冷源，在如此低的温度下，植物材料中参与新陈代谢的各种生物酶的活性受到极大抑制，生物体新陈代谢基本停止，处于“假死”状态。经过“假死”状态的生物材料能保持细胞正常的活性，并且遗传物质不发生变异。

1922年Knowlton报道将金鱼草（Antirrhinummajus）花粉在-180℃贮藏后仍具有一定的萌发率，这是有关花粉超低温保存最早的报道。20世纪80年代以来，关于花粉超低温保存的研究日渐兴起，日本、美国、中国及印度等国家相继建立了花粉超低温保存库。国内外已实现花粉超低温保存的植物种类涉及农作物、果树、园林植物、蔬菜、经济作物、药用植物以及牧草等几大类。花粉超低温保存技术能大大延长花粉的寿命，如水稻、紫菜苔、辣椒、芍药、番茄等花粉经长期超低温保存后依然具有较强的生活力，一些其他植物花粉甚至能保存10a（年）以上。

花粉超低温保存是种质资源保存的重要方式，与其他保存方法相比，其具有操作简单、占用空间小、保存成本低、安全稳定等优点。同时在育种实践和生产中，花粉超低温保存能够很好地克服花期不遇或花时不遇、异地授粉及父本种植面积大等问题。

1 花粉超低温保存的基本程序

1.1 花粉的采集

花粉采集受到植物花粉产量、散粉特性以及环境因子的影响。通常情况下，虫媒花花粉粒体积较大、花粉量少，采集较费时费力，风媒花花粉粒小，花粉量多，较易采集。不同植物的开花习性不同，但大多数植物在上午的散粉量最大。环境因子对花药开裂和散粉有很大影响，如开花前气温偏高，则花药会提前开裂。花粉采集选择在天气晴好的上午效果最好，雨天或雨后花药含水量太高且花粉易吸水胀裂，影响花粉生活力。采集花粉时可以根据花序开花顺序、花冠颜色、花药位置等信息采摘花药即将开裂的花朵，然后置于具有筛网的容器中通风干燥，筛出散落的花粉。

1.2花粉的干燥

花粉含水量是决定花粉超低温贮藏成功与否的关键因素。不同植物花粉都有其超低温保存的适宜含水量。张保才等认为辣椒花粉超低温保存适宜含水量为14.O%，此含水量的干燥花粉超低温贮藏1a后还能保持新鲜花粉一半的生活力，而未经干燥处理的辣椒花粉超低温贮藏30 d后生活力基本丧失：水稻超低温保存适宜含水量为13.24%，此时花粉田间授粉结实率达65%，且含水量在5.8%—29.6%的花粉经超低温保存后授粉均能结实，花粉含水量过高或过低均导致花粉超低温保存后授粉活性丧失。玉米最适宜超低温保存的含水量为11.3%～14.7%，未经干燥处理的花粉含水量高达53.3%，直接超低温保存导致其完全丧失授粉活性。无论是超低温贮藏还是低温贮藏，维持适宜的含水量是保持花粉正常活性的前提。魔芋花粉真空干燥后可在-20℃下长期保存，保存la后的花粉田间授粉率可达23.63%。陈宗光等研究发现西瓜花粉在低温（4℃）干燥（RH25%）条件下保存，前8d坐果率可达新鲜花粉的73%。宋红霞等以胡萝卜花粉为材料，试验结果同样也表明干燥贮藏有利于保持花粉的生活力。从目前的研究结果来看，花粉含水量多少是决定超低温保存成败的关键因素，含水量过高，投入液氮时易在细胞内形成冰晶，使细胞膜结构受到机械损伤导致细胞死亡；含水量过低，也会影响花粉活性。花粉干燥常用的方法有室内阴干法、干燥剂干燥法、白炽灯照射法等，均能获得较好的效果。

1.3预冻处理

大量研究表明预冻处理和化冻处理对超低温保存后的花粉活性影响较大，液氮对植物细胞和组织的伤害主要发生在冰冻和化冻这两个过程中，赵树仁等研究结果表明-25℃预冻处理30min能显著提高番茄花粉超低温保存后的萌发率。时婷婷等认为百合花粉超低温保存以-20℃预冻处理30min效果最好。汤青林等认为预冻处理可提高甘蓝花粉保存效果，且-20℃预冻处理效果最佳，萌发率达38.17%。王玉萍以马铃薯花粉为材料，发现0、-20℃预冻处理的花粉其相对活力与不经预冻处理的对照组间差异不显著，而经0℃（12h）→-10℃（12h）→-20℃（12h）程序降温处理的花粉活力高于对照。也有报道称预冻处理对花粉超低温保存效果没有显著影响。尚晓倩等f吲研究发现，预冻处理后的花粉超低温保存效果反而较直接投入液氮的保存效果差。造成预冻处理效果差异大的主要原因与花粉含水量不同和植物材料种类差异有关。刘燕等认为，决定是否进行预冻处理由花粉含水量决定，当花药含水量较高时，经预冻处理的花粉保存效果好于直接投入液氮的，这可能因为预冻处理后细胞内的水分向细胞间隙移动，细胞质的可溶性物质浓度升高，导致细胞质冰点降低，而当材料含水量较低时，直接投入液氮保存效果较好，此时细胞内的水来不及结冰，直接达到玻璃化状态。

1.4化冻处理

化冻也是花粉超低温保存的重要环节。在化冻过程中要避免细胞内的次生结冰，同时要防止化冻吸水对细胞膜产生的渗透冲击。冰晶在-3—-50℃的温度范围内最容易形成和生长，这个温度区间称之为超低温伤害的“危险温度区”，材料温度处于这一温度区间时细胞内的自由水可能发生同核结晶，但这些微小冰晶并不会对细胞产生伤害，此时如果解冻速度太慢，使材料长时间处于这一温度区间，更多的自由水就会以同核结晶形成的微小冰晶为结晶核而发生重结晶，直接导致冰晶变大引起伤害。比较番茄花粉在23℃水浴、37℃水浴、0℃水冲洗和自来水冲洗4种不同解冻方法对超低温保存的花粉活力的影响，发现自来水冲洗效果较为理想。刘燕等采用室温、自来水冲洗和温水浴3种化冻方式对梅花花粉进行处理，发现自来水冲洗和温水浴化冻效果较好。以百合花粉为材料，采用不同的化冻方法对花粉萌发率进行研究，结果表明40℃水浴化冻后花粉的萌发率极显著高于室温化冻和4℃冰箱缓慢化冻。王玉萍研究表明，不同化冻方法对马铃薯花粉超低温保存有明显影响，-20℃（12h）→4℃（12h）→25℃（12h）梯度解冻花粉活力最高，35～40℃水浴解冻次之。

2 花粉生活力检测

花粉生活力检验方法主要有染色法、离体萌发法及田问授粉法等。花粉染色法主要有氯化三苯基四氮唑染色法（TTC法）、联苯胺染色法等。氯化三苯基四氮唑是一种氧化还原染料，它的氧化态是无色的，活细胞的脱氢酶可以将TTC还原为红色的三苯甲潛（TTF）。联苯胺染色法是根据花粉中过氧化物酶的活性来判断花粉的活性，具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶，该酶与所用试剂发生氧化反应而产生颜色，根据颜色可知花粉有无活性？花粉离体萌发法是测定花粉活力的常用方法，由于其检测效果较为准确，广泛用于各种植物花粉活性检测。测定时配制一定浓度的培养基（基本成分为蔗糖和硼酸），在人工控制条件下培养一段时间，然后在显微镜下观察花粉的萌发，根据花粉发芽率的高低衡量花粉生活力大小。花粉发芽的标准以花粉管伸长超过花粉直径为准。花粉离体萌发法准确度高，但操作相对复杂，且花粉萌发易受培养基配方的影响而导致结果与实际不完全相符。田间授粉法是衡量花粉生活力最直接最具实际应用价值的方法，但其比较费时费力，还易受到外界环境如病虫害、机械损伤的影响。

3 超低温保存遗传稳定性

理论上，花粉在超低温保存过程中其细胞新陈代谢与生长发育近乎完全停止，处于“假死”状态，因而花粉遗传性状不会发生改变。大多数研究表明，超低温保存不会产生表型特征的变化。Mou-kadiri等以水稻超低温保存后的愈伤组织为材料，发现超低温保存后的再生后代植株的表型性状没有发生变异、石思信等以超低温保存1—2a的玉米花粉为材料，发现后代植株田间农艺性状、染色体数日和结构以及过氧化物酶同工酶和醇溶蛋图谱都没有异常。通过各种分子标记技术对超低温保存12个月的袋鼠花（Anigozanthos flavidus）的茎尖基因组DNA进行分析，发现其遗传稳定性良好，基因组没有发生遗传变异。Crisp等对花椰菜花粉超低温保存农艺性状的研究巾发现，花粉冷冻前后结实率没有差异，其后代性状没有表现出基因型的改变。陈芳等利用AFLP技术分析小麦超低温保存前后基因组DNA序列的变化，发现样品处理前后带型一致，未检测到明显带型差异进一步利用MSAP技术分析了样品超低温保存前后基因组甲基化水平，检测结果发现超低温保存后样品发生了甲基化变异，且以脱甲基化为主何艳霞等研究发现，拟南芥超低温保存对材料甲基化状态有影响，有新产生的甲基化也有脱甲基化，且脱甲基化是主要趋势。基因组甲基化水平对于维持基因组的稳定性和基因表达具有重要作用，其水平过高或过低，都会导致植物生长发育异常，且这种特征仃时可以连续遗传很多代。

4超低温保存机理研究

4.1 膜系统与超低温保存

细胞膜既维持细胞稳定代谢的胞内环境，义洲控物质进出细胞。“膜脂相变冷害”假说认为，在低温胁迫下，植物生物膜首先从液品相变为凝胶相，膜收缩产生孑L道或龟裂，质膜的分子结构发生了变化，导致质膜透性不同程度增大，膜内离子和溶质大量向外渗，细胞内外离子平衡遭到破坏，研究认为，V-ATPase是各种膜结合酶中对低温最敏感的，在10℃以下，其亚基解聚或酶分子处于松散状态，活性降低甚至完全失活。以超低温保存后的芍药花粉为材料，发现其细胞膜透性在超低温保存后均显著增加，且随保存时间延长，细胞膜透性持续L升。

4.2细胞内物质与超低温保存

植物在低温胁迫下，细胞内的物质如可溶性糖、氨基酸、蛋白质等发生急剧变化，通过可溶物质积累来响应低温胁迫。可溶性糖作为渗透调节物质，可以增加细胞渗透压，提高细胞的保水能力，还可以降低细胞质冰点，防止细胞质凝胶凝固。刘燕在对玻璃化超低温保存拟南芥的研究中发现，糖的转变量对幼苗耐液氮冻存起到了一定的作川

通常情况下，植物体内的游离氨基酸维持在一个较低的水平，而在低温胁迫下，游离氨基酸大量积累。游离氨基酸既能增加细胞液的浓度，又能提高原生质的保水能力及胶体的稳定性。在游离氨基酸中，脯氨酸与植物抗寒性密切相关。脯氨酸的疏水吡咯烷环能与蛋白质分子的疏水区结合，而亲水基团分布于表面，增强了蛋白质的可溶性。

可溶性蛋白与植物抗冷性密切相关。多数研究者认为，较高的可溶性蛋白含量有利于提高植物的抗冷性。可溶性蛋白具有较强的亲水性能，能够增强细胞的持水能力。尚晓倩在对芍药花粉可溶性蛋白含量进行测定后发现，超低温保存后其可溶性蛋白含量显著上升。

4.3 植物抗氧化酶系统与超低温保存

活性氧（ROS）是一类具有较高化学反应活性的氧衍生物，包括超氧物阴离子白由基（O2ˉ）、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）等。ROS能引起植物体内大分子物质如脂类、蛋白质及DNA的损伤。植物抗氧化酶系统包括超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）及过氧化氢酶（CAT）等。低温胁迫能激发植物抗氧化酶系统，从而提高植物的耐冷性。

4.4抗冻蛋白与超低温保存

抗冻蛋白（antifreeze proteins，AFPs）是低温生物为适应极端寒冷而产生的一种多肽或糖肽，它能直接和冰晶形成相互作用的蛋白质。最初它是从极区海鱼中发现的，至今在细菌、真菌、昆虫和植物中均有发现。AFPs以非依数性形式降低水溶液的冰点，但对熔点影响甚微，将这种水溶液的熔点和冰点之间出现的差值称为热滞活性（thermal hystere-sis activitV，THA）。 AFPs在植物中既能抑制冰的重晶化，又能减缓冰晶的生长速度或降低结冰水的百分比。1992年，Griffith等首次报道获得植物内生AFP，他们在能够忍受细胞外结冰的冬黑麦中发现了内源AFP，并从冬黑麦叶片的质外体中提取并纯化了该蛋白。1994年，我国学者费云标等从沙冬青叶片中分离到了AFP。1998年，第1个AFPs基因从胡萝卜中分离到，标志着首个AFP基因克隆成功。此后，冬黑麦具有几丁质酶活性的抗冻基因CHT9和CHT46、欧白英AFPs基因sthp-64等相继被克隆。

5 问题与展望

目前，花粉超低温保存技术已经成功应用于各种农作物、瓜菜、园艺作物和中草药等植物。从研究对象来看，主要集中在农作物和果树上，对花卉和观赏植物研究较少。目前花粉超低温保存主要集中在对适宜含水量、预冻处理和化冻处理方式等的研究上，尚未建立标准化的超低温保存操作流程，而且对超低温保存遗传稳定性和冻存机理研究较少。近年来，随着分子生物学和细胞学等领域的发展，各学科相互渗透，推进了花粉超低温保存研究的不断深入。尽管植物花粉进行超低温保存的条件不同，甚至同种植物不同品种间也具有较大差异，这使超低温保存在大规模实际应用中存在困难，但花粉超低温保存具有巨大的应用价值，尤其是在保护珍稀濒危植物种质资源，解决育种中花期不遇、异地授粉以及减少父本种植面积上将发挥重要作用。