一种简单的甜瓜白粉茵单孢子分离方法

郭丽霞 张永兵 李寐华 张学军

摘要：为了建立一种新的甜瓜白粉病病原菌单孢子分离方法，采用眉毛挑针挑取法，即在实体解剖镜下，在水琼脂培养基上直接挑取单个孢子进行活体分离纯培养.结果表明，此方法简单快速、操作方便、易于掌握，非常适用丁孢子较大且活体寄生的病原菌。首次建立了甜瓜白粉病单个孢子活体分离纯培养的方法，为甜瓜白粉病生理小种及相关育种研究奠定了基础。

关键词：甜瓜；白粉病；单孢分离

甜瓜（Cucumi.s m.elo L.）为葫芦科（CuCurbitace-ae）甜瓜属（Cucumi.s Linn）一年生草本植物，是国内外重要的园艺作物和经济作物。甜瓜白粉病是一种广泛发生的世界性病害，在瓜类作物上均可严重发牛，甜瓜白粉病可导致植株冠层减少，单株坐果率降低，从而造成减产，且易使果实变小，导致商品价值降低，世界各国都十分重视甜瓜白粉病抗病育种工作。就目前所知，危害瓜类的白粉病菌有3个属6个种，其中最主要的危害来自甜瓜白粉病瓜单囊壳白粉菌Poclosphaera xanthzi（原称Sphaerothe-（ca fuliginea）和二孢白粉菌Golovinamyces cichora-cearum（原称Erysiphc cichoracearum）；瓜类白粉病的生理小种多、分化快，仅单囊壳白粉菌就包含很多生理小种，目前已经发现的有11个生理小种，分别是小种0、1、2U.S、2France、3、4、5、Nl、N2、N3和N4；二孢白粉菌有2个生理小种，分别是小种0和。甜瓜白粉病是一种专性活体寄生菌，不能在人工培养基上分离培养，只能活体保存 至今还没有关于甜瓜白粉病单孢子分离的研究报告，日.传统保存方法不严谨，一般仅可保存菌种1个月，还容易造成小种交叉污染，这对生理小种众多的甜瓜白粉病研究及抗病育种来说无疑是致命的，因而探索出一种合适的甜瓜白粉病菌单孢子分离方法，对病原菌长期保存、病原菌问互作及遗传多样性分析和分子标记辅助育种等至关重要。本文在借鉴前人在其他病原菌单孢分离的基础上，采用眉毛挑针挑取法获得了甜瓜白粉病单孢分离的纯培养，

l 材料与方法

1.1材料

新鲜的白粉菌，解剖镜，眉毛，牙签若干，透明胶布一卷，剪刀，解剖刀，解剖针，镊子，培养皿，吸水纸，移液器，记号笔，琼脂粉，甘露醇，苯并咪唑，去离子水，75%乙醇（后同），硫酸霉素。供试甜瓜品种为‘伽师瓜。

1.2方法

1.2.1 水琼脂（WA）的制备称取12 g琼脂粉，加入1 000 mL去离子水，121℃高压灭菌20min，冷却到45℃加入医用硫酸霉素至终质量浓度50μg'mL-1.

1.2.2甘露醇培养基的制备称取10g甘露醇、9g琼脂粉、30mg苯并咪唑，加入1000mL去离子水，121℃高压灭菌20mins，冷却到45℃加入医用硫酸霉素至终质量浓度50μg·mL-1。

1.2.3 眉毛挑针的制备拔取眉毛1～2根，用透明胶带把眉毛粘到牙签上，再用剪刀剪去前端0.5cm长度，注意，一定要用剪刀剪去眉毛前端，有利挑取分生孢子一

1.2.4 白粉病菌单孢子挑取方法营养钵中播种‘伽师瓜种子，室温育苗。‘伽师瓜苗长出后的6～10d，田间采集白粉病叶，放在冰盒中，带回实验室处理.叶表面喷撒无菌水，4℃冰箱中过夜。将实验需要的材料放在无菌操作台中，紫外灯灭菌。然后把带有白粉病菌叶片在超净工作台边缘用洗耳球吹入水琼脂平板上，盖上盖，放解剖镜下；取若干‘伽师瓜苗子叶，用75%的乙醇表面消毒.子叶吹十后，放入甘露醇培养基中；调整目镜和物镜距离，直到找到无色透明的白粉病菌孢子，眉毛挑针挑取单个白粉病菌分生孢子放在子叶上面，标记日期及实验内容二放入培养箱，白天22℃，夜晚18℃，12h光周期培养。7d以后开始观察，记录结果。

2 结果与分析

如图1所示，菌落单一，生长良好，已经获得白粉菌单孢子纯培养。培养7d（图1-A）病原菌已经侵染显现出病症；培养10d病原菌缓慢生长，孢子堆逐渐变大（图l-B）；培养14d病原菌生长快速，已近开始影响子叶，子叶开始变黄（图1-C）。

3 讨论与结论

关于病原菌单孢子分离培养的研究取得了一定进展，但是主要是集中在其他作物上的能在人工培养基上培养的一些病原菌。孙广宇等针对黑粉菌的病原菌链隔孢在解剖镜下进行单孢子分离取得了很好的效果；林代福用眉毛挑针法对水稻稻瘟病单孢子分离简单、易行、无污染；张昊等用平板稀释划线法解决了体积小、颜色淡等镰刀菌类型的单孢子分离技术。甜瓜白粉病是活体寄生，病原菌单孢子分离技术一直处于空白，本文首次报道了甜瓜白粉菌单孢子分离方法，方法简单易行，准确无误。

由于甜瓜白粉菌单孢子眉毛挑针分离方法是把分生孢子吹到水琼脂上迸行挑取，很难保证每次挑取的单孢子都具有活性，需要挑取大量的单孢子，工作量相应会增加，如何能够保证每次都能挑取有活力的白粉菌分生孢子需要进一步研究。

甜瓜白粉病菌单孢子分离的成功运用对今后甜瓜白粉病菌毒性变异及寄主病原互作的各类相关研究、病原菌遗传多样性分析、甜瓜抗病育种分子标记、聚合育种及甜瓜抗性基因定位、克隆等研究具有重大意义，同时该方法对其他作物白粉病单孢子分离具有借鉴指导意义。