黄瓜新品种‘津优401’种子纯度的SSR鉴定

崔兴华　韩毅科　杜胜利　魏爱民　陈正武　刘楠

摘要：为了改变现有的田间检测周期长以及受气候条件影响的弊端，建立一种高效、准确的纯度检测方法，采用SSR分子标记技术对黄瓜新品种‘津优401种子的纯度鉴定结果进行比较。结果表明：在备选的100对引物中有12对引物在亲本间出现多态性互补的条带，尤其引物N67和N87，由于它们的特异性强、条带清晰的特点以及与田间鉴定的高度吻合被选为鉴定‘津优401黄瓜新品种种子纯度的标记引物，从而将以往该品种种子纯度鉴定的时间从2～3个月缩短到4～5h。

关键词：黄瓜；‘津优401；纯度；SSR标记

黄瓜是我国保护地种植面积最大的蔬菜之一，一年内可以多茬栽培，需种量大，供应期长。随着人民需求的多样化，对黄瓜品种类型的需求也逐渐趋向多种多样，因此育种单位要根据不同地区的需求进行定向的育种和繁育籽种。这样不仅增加了育种单位育种工作量，同时也加大了育种单位保证种子质量的难度，而种子的纯度作为衡量种子内部质量重要的指标之一也越来越受到种子生产单位和使用者的重视。既准确又快速的鉴定商品种子纯度的方法成为种子销售前保证种子质量的关键。

近些年随着分子标记技术的研究深入，使得利用分子标记来对黄瓜商品种进行纯度鉴定成为了一种快速、准确的方法。天津科润农业科技股份有限公司多年来致力于分子标记在黄瓜种子纯度鉴定上的应用研究，逐步开发了一套完善的种子纯度鉴定体系。‘津优401是天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所最新研制的露地专用黄瓜新品种，为保证‘津优401的商品种质量，现以‘津优401父本、母本以及‘津优401为材料，利用SSR技术筛选‘津优401的特异引物用于‘津优401种子的纯度鉴定。

1.材料与方法

1.1试验材料

‘津优401黄瓜及其父、母本。天津科润农业科技股份有限公司培育品种。

1.2DNA提取

采用CTAB法提取种子基因组DNA。将‘津优401及其父、母本种子分别放入恒温箱内催芽36h以上，取种子发芽的根尖部位1cm左右放置EP管内，加入200μL CTAB提取液充分研磨、混匀，放置65℃水浴5min；加入200μL氯仿：异戊醇（24：1）倒置混匀；放置离心机中12000r·min^-1离心5min后取上清液100μL；向上清液中加入70μL异丙醇（-20℃）充分混匀，静止5 min后，8000r·min^-1离心5min；倒掉上清液倒置风干后加入1×TE溶解DNA。

1.3‘津优401特异引物的筛选

以上述‘津优401及其父、母本的基因组DNA为模板，按照表1所示的SSR扩增体系以及表2所示的反应条件进行PCR扩增。扩增结束后，将变性剂加人扩增产物变性后采用5%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。观察父、母本以及‘津优401的条带位置筛选特异引物。

1.4‘津优401特异引物的验证

随机抽取100粒‘津优401种子同时用筛选获得的特异引物和田间种植进行品种纯度的鉴定，比较2种方法的鉴定结果，验证利用SSR技术进行‘津优401种子纯度鉴定的准确性，并将此方法应用到商品种的纯度鉴定当中。

2.结果与分析

2.1‘津优401特异引物的筛选

利用100对SSR引物对‘津优401黄瓜新品种进行特异引物的筛选。通过PCR扩增以及电泳分离，在备选的100对引物当中，有12对引物在亲本之间表现为共显性分离，‘津优401的带型表现为双亲的互补。在存在共显性分离的12对SSR引物当中有2对引物N67和N87（图1）由于条带清晰并且特异性强被选为鉴定黄瓜‘津优401纯度的特异引物。

2.2‘津优401特异引物的验证

同时用上述筛选获得的2对SSR引物采用分子标记和田间栽培的方式对100粒‘津优401种子进行纯度鉴定，结果显示SSR技术鉴定种子纯度与田间鉴定方式的准确度都能达到96%以上（表3）。

2.3‘津优401商品种纯度检测

自‘津优401黄瓜新品种育成销售开始就采用SSR技术在室内进行种子的纯度鉴定工作，并同时辅助田间鉴定进行验证，2011年至今4年间累计使用SSR技术检测‘津优401商品种10t以上，大大缩短了从采种到销售的时间，提高了效率，节约了资源。

3.讨论

田间检测虽然具有简单、直观以及便于观察的优点，但是也存在周期长、工作量大、成本高、容易受环境因素影响以及需要大量土地等缺点。人民大众对黄瓜品质的多样化和多变性要求日渐强烈，使得育种单位在第一年繁育的籽种类型不一定满足第二年人民大众对黄瓜商品性的要求，因此育种单位必须找到一种快速、高效并且准确的种子纯度鉴定方法，使其能在当年就能对种子纯度鉴定后进行籽种销售。本研究利用SSR分子标记的方法进行黄瓜籽种的纯度鉴定，结果表明在备选的100对引物中有2对引物（N67和N87）在‘津优401和亲本中能够表现特异性明显的多态性，并且通过与田间检测的相互对比，准确率极高。最后确定此两对引物可以用于该品种的籽种纯度鉴定。这样就将原来的田间检测的时间从2～3个月缩短至5-6h就能够完成，最大程度的保证了该品种能够及时投放市场，满足人民群众对黄瓜籽种的需求。

此外，天津科润黄瓜研究所经过多年的研究，将整个SSR分子标记检测体系在以往的基础上进行了改进，在不影响检测结果的前提下从检测时间和检测成本上都进行了优化。首先将人工研磨改为使用45孔研磨机进行研磨，从以往人工研磨每样20s缩短至45样30s，效率提高近30倍；其次本研究将电泳分离胶从琼脂糖凝胶改为聚丙烯酰胺凝胶，这样点样量从原来的每块胶的20-40个样扩大到近1000个样，效率提高了20倍以上；其三还通过优化品种基因组DNA提取过程的离心和水浴时间，从原来的10min缩短至5min，时间节约了一半。通过这些技术上的改进优化检测流程大大提高了检测效率，不仅大量节约了检测时间，同时也降低了检测成本。