茄科植物PAL基因家族的鉴定和序列分析

盖江涛　陈振玺　王鹏

摘 要 苯丙氨酸解氨酶（PAL，phenylalanine ammonia-lyase[EC：4.3.1.24]）是植物次生代谢尤其是苯丙烷途径的关键酶，与植物抵抗病原菌入侵密切相关，具有重要的植物生理学意义；其催化产物是辣椒素等植物天然产物的前体。采用BLASTP方法，依托全基因组数据库，获得了番茄、马铃薯、本氏烟草、辣椒等4种茄科植物及杨树、拟南芥的PAL基因家族成员共27条序列，并对其进行初步的生物信息学分析、理化性质分析及结构分析。结果表明：在进化过程中，茄科植物烟草、番茄、马铃薯和辣椒的亲缘关系较近，拟南芥、杨树与茄科植物的亲缘关系较远；酸性蛋白质占96.3%，所有蛋白均为亲水性稳定蛋白、有明显跨膜现象、无信号肽；所有PAL亚细胞定位于细胞质中，具有活性位点的蛋白占96.3%。本研究结果为进一步研究茄科植物中PAL代谢机理提供理论支持。

关键词 苯丙氨酸解氨酶；PAL；基因家族；氨基酸；茄科

中图分类号 Q949.777.7 文献标识码 A

Abstract Phenylalanine ammonialyase（PAL， EC：4. 3. 1. 24）is a critical enzyme in secondary metabolism of plants， which has significant biological relevance and strong ability against bacteria； also， its product provides precursor for plant natural products such as capsaicinoids. In this study， based on the genome database， 27 peptide sequences belonging to phenylalanine ammonialyase gene family were obtained from Lycopersicon esculentum Mill. （syn. Solanum lycopersicum L.）， Solanum tuberosum L.， Nicotiana benthamiana Domin， Capsicum annuum L.， Populus trichocarpa L and Arabidopsis thaliana（L.）Heynh by BLASTP， and analysed by bioinformatics， physico-chemical properties， structural analysis. The analysis showed that tobacco， tomatoes， potatoes and peppers have close genetic relationship， then Arabidopsis thaliana， poplar is further in evolution. Acidic protein is 96.3%. All PAL proteins are located in cytoplasm， hydrophilic， stable， transmembrane， no signal， and 96.3% of the protein has the active site. The anaytical results provide data for the next study of Solanaceae metabolic mechanism.

Key words Phenylalanine ammonia-lyase；PAL；Gene family；Amino acid；Solanaceae

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.005

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC：4.3.1.24）是一种与植物抗病性相关的酶。它通过催化L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）脱氨生成肉桂酸和氨，进而合成多种具有抗菌作用的产物，是植物体内次生代谢的关键酶和限速酶，其酶活性的高低与植物的抗病性密切相关[1]。

植物在遭受冷害[2-4]、伤害[5-6]和病原菌侵染[7]等情况下，PAL活性迅速上升。在马铃薯晚疫病[8]、茄子黄萎病[9]、烟草赤星病[10]及烟草受TMV浸染[11]的研究结果中都表明苯丙氨酸解氨酶活性变化和植物抗性关系密切。因此，PAL活性可作为植物抗逆境能力的一个生理指标。

目前，有关PAL基因与茄科植物抗性的研究已有报道，如利用病原菌侵染番茄，植物感病后，结果发现番茄品种的抗病性与其接种后体内PAL酶活性变化呈正相关[12-14]；王萱[1]以不同抗性辣椒品种为材料，研究了辣椒白粉菌侵染过程中PAL与品种抗性之间的关系及不同叶位叶片组织内PAL 活性变化，结果表明辣椒白粉病抗性与PAL活性呈正相关关系，且接种叶片的上、下位叶片组织中PAL活性也均提高，说明接种叶片受白粉菌侵染后会对相邻非接种叶片产生诱导抗性。此外，它的产物还是辣椒中辣椒素前体香兰素胺（vanillylamine）合成的第一步关键酶[15]。

在模式植物拟南芥中，PAL基因家族有4个基因，分别为PAL1（AT2G37040）、 PAL2（AT3G53260）、 PAL3（AT5G04230）、 PAL4（AT3G10340）[16]。研究报道，PAL1、PAL2和PAL4基因在植物维管系统的木质素合成过程中起作用，PAL3的作用较弱[16]，PAL1和PAL2也在类黄酮生物合成过程中有重要作用[17]。在杨树中，PAL的活性主要在正在发育的木质部、嫩茎和嫩叶中最高，而老茎和成熟叶中PAL的活性则很低[18]。

本研究以已知PAL基因功能的拟南芥 [Arabidopsis thaliana（Linnaeus）Heynhold]和杨树[Populus trichocarpa Linnaeus]的PAL序列作为参考，以 4种基因组测序工作已经完成的茄科（Solanaceae）植物番茄（Lycopersicon esculentum Miller， 异名Solanum lycopersicum Linnaeus）、马铃薯（Solanum tuberosum Linnaeus）、本氏烟草（Nicotiana benthamiana Domin）和辣椒（Capsicum annuum Linnaeus）作为研究对象，以其全基因组数据库为依据，通过BLAST的方法获得了这4种茄科植物PAL基因家族的全部序列，通过系统发育分析、理化性质分析等生物信息学方法分析PAL基因，比较茄科植物中PAL基因家族的特性，为进一步研究茄科植物中PAL基因的功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 数据库搜索

从phytozome V9.1（http：//www.phytozome.net）[19]、茄科植物基因组数据库（http：//solgenomics.net/）中搜索得到拟南芥、杨树、番茄、马铃薯、本氏烟草、辣椒的PAL基因信息，并下载数据库中的蛋白序列。

1.2 多序列比对分析

用MAFFT[20]软件对所得数据进行多序列比对，比对结果保存为fasta格式，并于MEAG6.0[21]中对比对结果进行手动调整。将调整后的序列保存为“.nex”格式以备后续分析。

1.3 系统发育分析

用Mrbayes3.1.2对序列进行系统聚类分析，设置1 000 000代检测，取样频率为1 000，4条Markov链，其余参数均为软件默认值，2次运行，分裂频率（Split frequencies）小于0.01时终止运行。所得的系统发育进化树在Figtree version 1.3.1软件中进行查看、编辑。

1.4 蛋白质的生物信息学分析

用ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）[22]在线工具预测分析蛋白质的理化性质，应用TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/software/TMP-

RED-form.html）在线分析来预测蛋白质跨膜区和跨膜方向，亚细胞定位应用Cell-Ploc 2.0 package软件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行在线分析。用TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）在线预测氨基酸序列导肽，在signalP 4.1 server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）中完成蛋白质信号肽的预测。活性位点运用在线分析软件ExPASy（http：//prosite.expasy.org/）进行分析。

2 结果与分析

2.1 PAL基因家族的系统进化分析

通过BLASTP的方法，去掉重复序列及结构域不完整序列，共得到27条氨基酸序列，其中拟南芥4条、番茄6条、马铃薯5条、辣椒4条、本氏烟草3条、杨树5条。对27条编码PAL的氨基酸序列进行系统发育分析（图1）。由图1可知，这27条PAL基因家族序列聚为明显的2枝。拟南芥的4个PAL基因、杨树的5个PAL基因、马铃薯的1个PAL基因、辣椒的2个PAL基因、本氏烟草1个PAL基因、番茄的1个PAL基因聚为一枝，说明在进化过程中杨树、拟南芥的亲缘关系较近；而茄科植物番茄的5个PAL基因、马铃薯的4个PAL基因、辣椒的2个PAL基因、本氏烟草2个PAL基因聚为一枝，说明茄科植物的亲缘关系较近，而且PAL基因的分化在这4种茄科植物物种形成前完成。

在已知的拟南芥PAL基因功能的前提下，可推测出与拟南芥最近的分枝上的5条基因可能具有与拟南芥PAL基因相似的功能，它们是：NbS000

08842g0012.1（本氏烟草）、Solyc05g056170.2.1（番茄）、 PGSC0003DMT400060308（马铃薯）、 CA12g15510（辣椒）、 CA05g20790（辣椒）。而另一分支上的13条PAL基因均属于茄科植物，且在每个物种中均呈现低拷贝，推测这些基因在茄科植物的形成中具有重要的生理功能。

2.2 PAL蛋白的理化性质分析

针对以上鉴定的27条氨基酸序列，笔者对其进行了理化性质分析。结果显示：除Nbe__NbS000040

18g0009.1为弱碱性蛋白（理论等电点pI=7.29）外，其余蛋白均为酸性蛋白质（理论等电点pI<7），占总蛋白的96.3%（图2）；根据Guruprasad方法[23]表明，所有蛋白均为稳定性蛋白（不稳定系数小于40）（图3）；相对分子量除Nbe__NbS00035803g00

15.1为105.38 ku外，其余位于71.84～81.17 ku范围内（图4）；所有蛋白均为亲水性稳定蛋白 （GRAVY<0），有明显跨膜现象，均无信号肽。半衰期一致表现为：序列的N-端为甲硫氨酸（Met），在哺乳动物的活体中半衰期30 h，在酵母活体中半衰期大于20 h，在大肠杆菌的活体中半衰期大于10 h。

2.3 PAL氨基酸导肽预测和可靠性分析

导肽（leader peptide）是一段引导新合成的肽链进入细胞器的识别序列[24]。在核糖体中合成的蛋白质，只有在正确的细胞部位并装配成结构和功能的复合体，才能参与细胞的生命活动。因此，导肽的预测和分析对了解蛋白质的亚细胞定位与功能作用途径和机制有一定的意义。氨基酸序列导肽的预测结果显示，27条氨基酸序列含有的叶绿体转运肽（Chloroplast transit peptide，CTP）、线粒体目标肽（Mitochon drial targeting pep-tide，MTP）及分泌途径信号肽（Signal peptide，SP）的分值均较低，仅烟草基因Nbe__NbS00

035803g0015.1具有线粒体目标肽，其余氨基酸序列均没有导肽（表1）。

2.4 PAL氨基酸序列的结构分析

3 讨论与结论

PAL是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢途径第一步反应的酶，是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶，苯丙烷类代谢途径的产物在植物生长发育过程中起着重要的作用，而这些物质的含量总是与PAL基因的活性密切相关，因此，PAL基因对植物有着非常重要的生理意义，并且也成为重要的研究对象。

本研究对拟南芥、杨树、番茄、马铃薯、本氏烟草和辣椒6种植物共27条PAL基因家族蛋白进行了系统发育分析，结果显示茄科植物本氏烟草、番茄、马铃薯和辣椒的亲缘关系较近，拟南芥、杨树与茄科植物的亲缘关系较远；且鉴定到茄科植物的13条序列与拟南芥、杨树的PAL基因分别在两2个分支，推测这些基因可能在茄科植物的形成过程中发挥了特定的生理生化功能。

理化性质分析得出茄科植物PAL基因家族表现出高度的一致性。酸性蛋白质占96.3%，所有蛋白均为有明显跨膜现象、无信号肽的亲水性稳定蛋白，且仅烟草基因Nbe__NbS00035803g0015.1具有线粒体目标肽，其余氨基酸序列均没有导肽。初步认为4种茄科植物中PAL基因家族编码的蛋白，不属于膜蛋白或分泌蛋白，它们由游离的核糖体合成，进入胞质溶胶，参与细胞内生化反应，推测在维持细胞内离子环境，细胞内代谢过程中发挥着重要作用。

结构分析结果显示，本试验选定的27条PAL基因中，除 Can__CA12g15510无活性位点外，其余26条PAL基因编码的蛋白均具有活性位点，从结构上初步认为这26条基因均属于PAL基因家族。同时，所有PAL基因亚细胞定位于细胞质中，这与已有的PAL基因的亚细胞定位研究结果一致[25]，也进一步说明PAL蛋白为非分泌蛋白，在细胞质内发挥作用。

目前，虽有一些关于茄科植物中PAL基因的研究，但都是对PAL生化活性的研究报道，从茄科植物PAL基因家族层面分析PAL基因的系统进化，并比较茄科植物中PAL基因的性质，还未曾报道。本研究以4种茄科植物PAL基因家族为研究对象，对其序列结构、性质、进化进行分析，为下一步研究茄科植物中PAL基因的功能提供了理论基础，对今后更好地利用PAL基因对茄科植物进行改造、增强茄科植物的抗性等有推动作用。

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