巴西橡胶树一个新的法尼基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

郭冬等

摘 要 利用同源克隆的方法在橡胶树中获得一个新的法尼基焦磷酸合酶基因，命名为HbFPS2。序列分析显示，HbFPS2基因组序列长4 171 bp，由12个外显子和11个内含子组成，cDNA全长1 288 bp，包含1 029 bp的开放阅读框、105 bp的5′-UTR和154 bp的3′-UTR，编码342个氨基酸，推测分子量为39.6 ku，等电点为5.27。氨基酸序列比对显示，HbFPS2具有FPS家族保守的5个结构域。进化分析结果表明，HbFPS2和HbFPS1亲缘关系最近，与大戟科的蓖麻、大戟、麻风树法尼基焦磷酸合酶聚为一个亚类。定量PCR结果表明，HbFPS2在橡胶树根、树皮、叶、花和胶乳等组织中均有表达，在花和胶乳中表达量较高，在根中表达量最低；茉莉酸和乙烯处理均能提高HbFPS2基因的表达量，处理9 h时基因表达量分别提高了36倍和8倍。结果为分析法尼基焦磷酸合酶基因表达特性及其在天然橡胶生物合成途径中的作用机制奠定基础。

关键词 巴西橡胶树；法尼基焦磷酸合酶；特异表达；茉莉酸；乙烯

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract Farnesyl pyrophosphate synthase is a key enzyme in nature rubber biosynthesis in Hevea brasiliensis. In this study， a new gene coding for farnesyl pyrophosphate synthase， designated as HbFPS2， was isolated by homology-based candidate gene method in Hevea brasiliensis. Sequence analysis revealed that the HbFPS2 genome sequence is 4 171 bp， contained 12 exons and 11 introns. The full-length cDNA of HbFPS2 is 1 288 bp with 1 029 bp open reading frame， encoding 342 amino acid residues with molecular mass of 39.6 ku， and pI 5.27. Multiple sequence alignment showed that the HbFPS2 included 5 domains with highly conserved amino acids. The phylogenetic analyses revealed that HbFPS2 belong to plant farnesyl pyrophosphate synthase family， in which Hevea brasiliensis， Ricinus communis， Euphorbia pekinensis and Jatropha curcas were clustered into one clade. The results of real time PCR analysis indicated that HbFPS2 expressed at different levels with the highest transcription in the flowers， followed by the latex， and lowest in the roots. The transcription of HbFPS2 was induced in the latex by jasmonic acid and ethylene， increased 36 and 8-fold respectively. This research lays a foundation for studying the gene expression pattern and regulating mechanisms of HbFPS2 in nature rubber biosynthesis.

Key word Hevea brasiliensis； Farnesyl pyrophosphate synthase； Differential expression； Jasmonic acid； Ethylene

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.001

橡胶树法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl pyrophosphate synthase，FPS）是天然橡胶生物合成途径中的关键酶之一。巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是天然橡胶的主要来源。天然橡胶是异戊二烯代谢途径的一个重要产物之一，同位示踪术和核磁共振成像技术研究结果表明，法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，FPP）是橡胶生物合成的起始物[1]。法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl pyrophosphate synthase，FPS，EC2. 5. 1/EC2. 5. 1. 10）是植物类异戊二烯合成途径中的一个重要关键酶，催化两分子的异戊烯基焦磷酸和一分子的二甲基丙烯基焦磷酸以1，4头尾连续缩合反应，形成15碳的FPP[2]。FPP还是植物体内甾醇、三萜、长醇、泛醌、类胡萝卜素等许多萜类衍生物质合成的前体物和蛋白质法尼基化的底物[3]。

FPS作为一种异戊烯基转移酶，研究最为广泛。20世纪90年代以来人们已经通过不同方法从橡胶树[4]、拟南芥（Arabidopsis thaliana）[5]、 白羽扇豆（Lupinus albus）[6-7]、水稻（Oryza sativa）[8]、番茄（Lycoperscion esculentum）[9]、玉米（Zea mays）[10]、青蒿（Artemisia annua）[11-12]、银胶菊（Parthenium argentatum）[13]、人参（Panax ginseng）[14]、银杏（Ginkgo biloba）[15]等几十种植物中克隆出编码FPS的基因。通过对多个物种的FPS序列比对发现，来源不同的FPS序列具有高度相似性，含有5个保守的结构域（Ⅰ-Ⅴ）[15]，其中2个富含天冬氨酸的DDXXD（D代表天冬氨酸，X代表任意氨基酸）结构域Ⅱ和Ⅴ，被认为是酶活性中心组成部分，对催化功能起决定作用[16]。FPS是一类代谢同工酶，是一个小的基因家族编码产物。在拟南芥、水稻、青蒿、白羽扇豆、银胶菊等植物中存在至少2个FPS基因同分异构体组成的基因家族。目前橡胶树中除已分离出的HbFPS1基因外[4]，还未见有新的FPS家族成员报道。

本研究运用同源序列法和快速cDNA末端扩增技术（RACE）克隆橡胶树新的法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS2，并进行生物信息学分析；采用定量PCR技术比较HbFPS2在橡胶树不同组织中的表达情况，并研究了茉莉酸和乙烯处理对胶乳中HbFPS2表达情况的影响，为进一步研究法尼基焦磷酸和酶基因在天然橡胶生物合成途径中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 橡胶树胶乳、树皮、根、花和树叶等组织均采自中国热带农业科学院试验农场的热研7-33-97品系巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）。胶乳采样按Tang等[17]的方法进行，然后用液氮收集。树皮、根、花和树叶采集后用液氮研磨，保存于-70 ℃。茉莉酸和乙烯利处理橡胶树按照Chen等[18]的方法进行。

1.1.2 质粒、试剂和菌种 克隆载体pMD19T simple Vector、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit、Advantage 2 PCR Kit和实时荧光定量PCR试剂SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ等均购自TaKaRa公司。E.coli DH5α由本实验室保存。其它生化试剂和常规试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 橡胶树RNA的提取 参照Tang等[17]的提取方法进行。

1.2.2 HbFPS基因家族的同源检索及基因组序列拼接及验证 按照Yang等[19]方法在NCBI中将橡胶树基因组序列（GenBank：AJJZ01000000）[20]和ncbi-blast-2.2.28t-win32软件下载，并按照BLAST Command Line Applications User Manual操作，构建橡胶树基因组本地化Blast检索数据库。使用HbFPS1的编码序列检索橡胶树基因组本地化数据库，获得HbFPS1同源序列，使用DNAMAN对基因组序列进行拼接。将检索获得新基因序列设计引物，扩增橡胶树cDNA进行验证。

2 结果与分析

2.1 HbFPS2的克隆

使用Adiwilaga和Kush[4]分离的HbFPS1编码序列（GenBank登录号：Z49786）检索本地化橡胶树基因组数据库，检索结果显示，橡胶树基因组序列中有两段与HbFPS1有较高同源性，其中AJJZ010231605共3 984 bp，部分序列与HbFPS1编码序列的1～545 bp同源；AJJZ010231606共12 573 bp，部分序列与HbFPS1编码序列547～1 029 bp同源，AJJZ010231605和AJJZ010231606的基因组序列不存在重叠区段。笔者推测这2个序列为同一基因的2个片段，因此设计引物扩增橡胶树胶乳cDNA第一链，获得约1.1 kb的特异扩增条带（图1-A），PCR产物测序结果显示，序列共1 070 bp，其中包含一个1 029 bp的ORF，与AJJZ010231605和AJJZ010231606拼接后的编码区外显子部分完全一致，表明AJJZ010231605和AJJZ010231606确实为同一基因的2个片段，将该基因命名为HbFPS2。通过5′RACE技术扩增得到约240 bp片段（图1-B），经测序获得105 bp的5′-UTR序列；通过3′RACE技术扩增得到约260 bp片段（图1-C），经测序获得154 bp的3′-UTR序列（图1-C），共得到1 288 bp的HbFPS2全长cDNA序列（图2）。使用引物FPS2F和FPS2R扩增胶乳cDNA，获得约1.3 kb片段（图1-D），测序结果与拼接后序列一致。

2.2 HbFPS2序列分析

利用primer5.0分析HbFPS2的完整阅读框为1 029 bp，对应基因组序列4 171 bp，编码342个氨基酸，预测分子量为39.6 ku，等电点为5.27。HbFPS2编码区与HbFPS1相比，核酸水平的相似性为92.42%，推导的氨基酸序列相似性为90.94%。利用在线软件GSDS对HbFPS2的编码序列和基因组序列比对显示，和HbFPS1一样，HbFPS2也由12个外显子和11个内含子组成，外显子与内含子的连接都符合“GT-AG”规则（图3）。从图中可以看出HbFPS1和HbFPS2的基因结构相似，12个外显子的长度和分布一致，显示出较强的保守性。

将橡胶树和拟南芥、番茄、玉米、水稻等植物的FPS氨基酸序列比对显示，HbFPS与拟南芥AtFPS1、AtFPS2、番茄LeFPS1、玉米ZmFPS、水稻OsFPS1、OsFPs2的同源性分别为77.49%、78.07%、76.61%、72.51%、71.64%和71.05%，表明各物种FPS基因在进化过程中相对保守。蛋白质序列比对分析表明，HbFPS2的功能域氨基酸组成与其他植物一致，均含有5个保守的结构域；结构域II和V富含天冬氨酸结构域（DDXXD），被认为是烯丙基转移酶与底物异戊烯基焦磷酸相结合的位点（图4）。

2.3 HbFPS2进化分析

对橡胶树、拟南芥、水稻、番茄、玉米、青蒿、银胶菊、白羽扇豆、人参、蓖麻（Ricinus communis）、大戟（Euphorbia pekinensis）、银杏、欧洲云杉（Picea abies）、洋甘菊（Matricaria chamomilla）、三七（Panax notoginseng）、曼地亚红豆杉（Taxus x media）、辣椒（Capsicum annuum）、向日葵（Helianthus annuus）、大豆（Glycine max）、麻风树（Jatropha curcas）等20个物种的27个FPS氨基酸序列进行分子进化分析，结果见图5所示。27个FPS氨基酸序列被聚为两大类，双子叶植物分为一类（A-F），单子叶植物和裸子植物聚为一类（G和H）。从图5可以看出，HbFPS2和HbFPS1的亲缘关系最近，与麻风树、大戟、蓖麻聚为双子叶植物中的大戟科分支（A）；其他双子叶植物又分别聚为豆科（B）、十字花科（C）、茄科（D）、五加科（E）和菊科（D）等不同分支。

2.4 HbFPS2的组织特异性表达

定量PCR分析橡胶树根、树皮、叶、花和胶乳等组织中HbFPS2的表达情况，结果表明，HbFPS2基因在所有组织中均有表达，其中在花中表达量最高，胶乳次之，在根中表达量最低（图6）；同时笔者也分析了HbFPS1基因在这些组织中的表达情况，结果表明，HbFPS1基因在所有组织中均有表达，其中在根中的表达量也是最低，在胶乳中的表达量显著高于其它组织，是根中表达量的65倍（图6）。HbFPS1在各组织的表达量均高于HbFPS2，在根、树皮、叶、花和胶乳中表达量分别为HbFPS2的16.9、33.5、30.3、7.1和318.2倍。

2.5 茉莉酸和乙烯处理对胶乳中HbFPS2基因表达的影响

定量PCR分析茉莉酸和乙烯处理后胶乳中HbFPS2的表达情况见图7。由图7可知，茉莉酸和乙烯诱导HbFPS2和HbFPS2的表达量都在9 h时达到最高水平。茉莉酸诱导9 h时，HbFPS2和HbFPS1的表达量都显著增加，分别是0 h的36倍和29倍；乙烯诱导9 h时，HbFPS2和HbFPS1的表达量增加不如茉莉酸显著，分别是0 h的8倍和7倍。

3 讨论与结论

本研究结合橡胶树基因组序列，利用同源序列法分离出一个新的基因HbFPS2。基因结构分析表明，HbFPS2和HbFPS1基因结构相似，外显子的位置和长度完全一致；推导的氨基酸序列与模式植物的FPS氨基酸序列具有较高的同源性，都具有FPS的5个保守结构域，表明结构域在分子进化过程中具有较高的稳定性，这可能与其在生物代谢中行使同一功能相关。两个富含天冬氨酸的结构域DDXXD被认为是酶与底物的结合位点，是这一类酶的活性中心[3]。这表明克隆的HbFPS2属于FPS基因家族，在以前的研究中还未见报道。进化分析显示，22种植物的FPS聚被为裸子植物、单子叶植物和双子叶植物三大类，HbFPS2与亲缘关系较近的大戟科植物聚为双子叶植物下的一个亚类，这也说明了植物在长期的分子进化过程中， 生物种属间的基因序列存在一定的同源性， 而同源性的高低与植物亲缘关系密切相关。

国内外学者研究认为，植物FPS基因表达具有组织特异性，并且伴随着类异戊二烯衍生物含量的而增加[22]。本研究中基因组织特异性表达结果显示，HbFPS2和HbFPS1在橡胶树各个组织中均有表达，但在各组织中表达强弱存在差异，具有组织特异性。HbFPS1在胶乳中高水平表达，在其它组织中表达水平较低，在根中表达最低；相对HbFPS1而言，HbFPS2在橡胶树中以较低水平表达，且在花中表达水平最高，胶乳次之，根中最低。HbFPS2和HbFPS1表达的差异，推测在橡胶树各组织中，HbFPS1在催化生成法尼基焦磷酸中可能起着主要作用。

茉莉酸和乙烯被认为参与天然橡胶的生物合成调控[23]，定量PCR研究显示，用茉莉酸和乙烯处理橡胶树，胶乳中均检测到HbFPS2和HbFPS1表达量有所上升，同一种激素处理对这两个基因的影响较为一致，我们推测在胶乳中可能HbFPS2和HbFPS1都参与了橡胶的生物合成，具体机制还有待进一步研究；相比较而言，茉莉酸对HbFPS2和HbFPS1的影响较乙烯更为显著，推测这两个基因可能受茉莉酸或乙烯信号的调控比较一致，有待分离HbFPS2调控序列后进行更进一步研究。本研究为进一步探索橡胶树法尼基焦磷酸合酶在天然橡胶生物合成中的作用机制、基因调控研究奠定了基础。

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