HIF－1α 及STAT3 联合预测异时性结直肠癌肝转移*

王 强，郭德正，刘焱伟，史 佳，黄 健，郝朗松

(1.贵州医科大学 外科教研室，贵州 贵阳 550004;2.贵州省人民医院 普外科，贵州 贵阳 550000;3.六安市立医院 普外科，安徽 六安237000;4.十堰市太和医院 普外科，湖北 十堰 442000)

结直肠癌治疗后的异时性肝转移(colorectal liver metastases，CRLM)是导致结直肠癌治疗失败及死亡的主要原因［1］。尽管转化治疗提高了CRLM 的可切除率，但效果仍不理想［2］。国外研究表明CRLM 危险因素中较为肯定的有年龄、术前癌胚抗原(CEA)水平［3］，但上述危险因素是否可用于国内患者尚存在争议。缺氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor，HIF－1α)是肿瘤在低氧状态下生物学特性改变的始动因素，其表达程度及稳定性与肿瘤的生物学特性、临床密切相关。既往研究证实HIF－1α 的表达程度与结直肠癌的预后、复发、生存、转移、亚型分类、肿瘤侵袭性相关［4］。信号传导转录激活因子3(Signal transducers and activators 3，STAT3)是HIF－1α 的协同刺激因子，可激活HIF－1α 下游目标基因(如血管内皮生长因子等)并驱动低氧环境下的HIF－1α 依赖性肿瘤发生［5］。本研究对2012 年3 月～2014 年8 月收治的68 例初诊结直肠癌患者的肿瘤组织中HIF－1α 与STAT3 蛋白水平进行测定，探讨HIF－1α与STAT3 蛋白水平与CRLM 发生率之间的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2012 年3 月～2014 年8 月收治的初诊结直肠癌患者68 例，男性43 例，女性25 例，中位年龄58岁(36 ～81 岁)。所有患者均经病理活检确诊，肿瘤位于直肠41 例、结肠27 例;肿块型肿瘤34 例，溃疡型21 例，浸润型13 例;高分化19 例，中度分化40 例，低分化8 例;中腺癌45 例，黏液腺癌18例，未分化癌5 例;Ⅰ～Ⅱ期30 例，Ⅲ～Ⅳ期38例;淋巴结转移36 例，无转移32 例;脉管侵犯29例，无脉管侵犯者39 例。对照组为结直肠息肉患者35 例，亦经内镜下病理活检确诊。结直肠癌的治疗均参照2010 年NCCN《结直肠癌诊疗指南中文版》进行。

1.2 观察指标

1.2.1 HIF－1α 及STAT3 的表达 所有受检者内镜下所取部分组织标本迅速冻存至－80 ℃，用以检测HIF－1α 及STAT3 的表达。采用Western－blot 法，利用液氮、研钵粉碎组织，加入RIPA 缓冲液，PMSF，采用Polytron 4 ℃15 000 r/min 匀浆1 min，移入离心管4℃15 000 r/min 离心15 min，取上清液，采用二喹啉甲酸(BCA，东莞市瓦里西化工有限公司)定量总蛋白。取30 μg 总蛋白经10%聚丙烯凝胶电泳、聚偏氟乙烯(PVDF)膜+5%脱脂牛奶室温封闭后，加入HI－1α(上海常斤生物科技有限公司)、STAT3 一抗(上海安妍生物科技有限公司)，4 ℃过夜孵育，洗膜后加入二抗，室温孵育1 h 再次洗膜，经化学发光(ECL)曝光(2 min)、显影(1 min)及定影，用凝胶图像处理系统分析蛋白条带灰度值，以β－actin 作为内参，按HIF－1α(或STAT3)/β－actin 计算两者的相对表达量。分析比较CRLM 病例与非CRLM 病例临床资料及HIF－1α 和STAT3 表达。

1.2.2 随访 所有患者随访6 ～22 月。

1.3 统计学分析

采用统计学软件SPSS 19.0 对数据进行分析。计量资料用均数±标准差表示，均数比较采用单因素方差分析，组内比较采用LSD 法。计数资料采用非参数检验的Fisher exact test 及Kruscal Wallis H 检测进行评估。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

经系统治疗后，68 例结直肠癌患者中，11 例在随访过程中出现CRLM(11/68，16.18%)。与初诊时的临床特征比较，非CRLM 组淋巴结转移患者明显低于CRLM 组，差异有统计学意义(P=0.036)，而年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤形态、分化程度、TNM分期、脉管侵犯等因素在CRLM 组与非CRLM 组间差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

2.2 STAT3 及HIF－1α 的蛋白表达

3 组患者STAT3、HIF－1α 蛋白表达水平两两比较，CRLM 组＞非CRLM 组＞对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见图1。

2.3 STAT3+、HIF－1α+不同组合时，CRLM 的发生率

STAT3 蛋白相对表达量中位数为2.1，HIF－1α 蛋白相对表达量中位数为1.7。分别根据蛋白表达的中位数将患者分为阴性组(≤中位数组，n=34)及阳性组组(＞中位数组，n=34)。不同组合见表2，结果显示初诊结直肠癌患者治疗前活检肿瘤组织STAT3、HIF－1α 同时过表达时，患者出现异时性CRLM 的几率明显高于单独过表达或均不过表达的患者(P ＜0.05)。见表2。

表1 非CRLM 组与CRLM 组患者就诊时临床特征Tab.1 Comparison of clinical features between CRLM and non－CRLM group

图1 不同分组中的HIF－1α、STAT3蛋的表达水平Fig 1.The variation trend of relative expression level of STAT3 and HIF－1αh group

表2 两组结直肠癌患者STAT3+与HIF－1α+不同组合时，CRLM 发生率Tab 2.The incidence rate of CRLM in terms of different combination of HIF－1α and STAT3 protein expression

3 讨论

肿瘤细胞的相对缺氧可应激性的导致HIF－1α 表达上调，并驱动糖酵解及肿瘤细胞的能量代谢及生物学特性改变，其上调程度与肿瘤患者的生存率、缓解率呈负相关，并可导致耐药及预后不良(独立危险因素)［6－8］。有研究表明HIF－1α 在结直肠癌早期即出现高表达，且随病程进展进行性增高，可作为肝脏转移的独立危险因素，而其他相关分子标记物如P53，血管内皮生长因子(VEGF)，Glut－1 及癌胚抗原－9(CA－9)等却并未显示出类似的相关性［9－11］。STAT3 可协同HIF－1α 激活HIF－1α 的下游基因并驱动低氧环境下的HIF－1α 依赖性肿瘤发生，并与人结直肠癌的临床特征、预后密切相关［12－14］。然而，目前尚无关于STAT3与HIF－1α 协同表达与结直肠癌CRLM 的相关临床报道。

本研究中，除淋巴结转移因素与CRLM 的发生有关外，与年龄、性别、肿瘤部位、直径、形态、分化程度、分期、脉管侵犯等因素无关。与既往研究倾向于将结直肠癌治疗前的淋巴结转移、年龄等作为异时性CRLM 的危险因素的观点不符［8－14］。可能是由于本次研究样本量较小所致。本研究还发现3 组患者STAT3、HIF－1α 蛋白表达水平两两比较，CRLM 组＞非CRLM 组＞对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。该结果与既往研究相同［10］。

本研究还对STAT3、HIF－1α 过表达(＞中位数)及未过表达(≤中位数)及其不同组合时的CRLM 发生率进行比较。结果表明当STAT3、HIF－1α 同时过表达时，患者出现异时性CRLM 的发生率为60%，明显高于两者均未过表达患者的10%。提示STAT3、HIF－1α 的蛋白表达程度联合分析可有效预测患者发生异时性CRLM 的发生率，可帮助临床医师在治疗前进行风险评估及制定更为有效的个体化治疗方案。

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