HDAC2 基因RNA 干扰载体的构建*

刘燕青，黄 健，黄韻祝＊＊＊，娄方方，孔维莹

(1.贵州医科大学 医学检验学院，贵州 贵阳 550004;2.贵州医科大学附院 生化科，贵州 贵阳 550004)

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)2 属于I 类HDACs 家族成员，在肿瘤的发生发展中具有重要作用［1］。HDAC 能调控细胞信号转导和基因表达，当HDAC 过量或乙酰基转移酶(HATs)的数量减少时，组蛋白乙酰化的平衡将偏向去乙酰化，从而导致基因表达的调节异常［1］。RNA 干扰(RNAi)技术是目前使用最广泛的功能基因组学研究手段，属于转录后基因沉默，具有高效率、高特异性、高稳定性和高穿透性等优点［2］。本实验参照HDAC2 基因序列，设计合成短发夹RNA(shRNA)结构的双链寡核苷酸片段，插入慢病毒表达载体pLKO.1-puro，构建并筛选针对人HDAC2 基因特异性的慢病毒干扰载体，为进一步研究HDAC2 在肿瘤发生和发展中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

pLKO.1-puro 慢病毒表达载体(美国addgene公司)，LB 培养基(OXID)，T4 DNA 连接酶、限制性内切酶AgeI、EcoRI 和XhoI(NEB 公司)，DNA 凝胶回收试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒、质粒小提中量试剂盒(北京TIANGEN 公司)，stbl2 大肠杆菌(实验室保存)，20 bp、1 kb DNA Ladder(Takara)，氨苄青霉素(sigma 公司)，阳离子脂质体LipofectamineTM2000、DNA 测序试剂盒(Invitrogen 公司)，引物由上海捷瑞生物公司合成;荧光倒置显微镜(NIKON)，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 特异性shRNA 干扰载体的设计 人HDAC2 shRNA 靶点设计:根据Sigma 公司干扰靶点 信 息(http://www.sigmaaldrich.com/catalog/genes/HDAC2?lang=zh＆region=CN)，挑选出3条基因特异性shRNA 序列(Human，HDAC2，NM_001527)，通过BLAST 同源性分析，排除非特异性抑制其他基因序列的可能。序列3＇端加入终止信号TTTTT，两端分别加入限制性内切酶AgeI 和EcoRI 的酶切位点黏性末端，中间加入Loop 环，构成的引物结构(AgeI 酶切位点+Sense+Loop+Antisense+终止信号+EcoRI 酶切位点);HDAC2-shRNA 序列见表1。

表1 针对人HDAC2 基因序列设计的寡核苷酸片段Tab.1 Oligonucleotide sequences of HDAC2 specific shRNAs

1.2.2 Oligo DNA 片段退火、线性质粒载体pLKO.1-puro 获得 将合成的八条Oligo 片段用pH 8.0 的TE 溶液稀释成100 μmol/L，按照下列体系进行退火反应，正向序列引物1 μL，反向序列引物1 μL，10×NEB buffer2 5 μL，双蒸水(ddH2O)43 μL;反应条件为95 ℃、5 min，70 ℃10 min，室温自然冷却，形成双链Oligo DNA 片段，4%琼脂糖凝胶电泳检测双链Oligo DNA 的完整性，产物于-20℃保存。挑取携带pLKO.1-puro 质粒的甘油菌接种含100 mg/L 氨苄青霉素(Amp)的LB 平板，37 ℃培养过夜。次日挑5 个单克隆增菌，提取质粒。在37 ℃用AgeI 和EcoRI 双酶切500 ng pLKO.1-puro 质粒载体使之线性化，酶切产物用0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳，凝胶切割回收7 kb 的pLKO.1-puro 骨架大片段，20 μL ddH2O 洗脱。

1.2.3 感受态细胞制备 挑取4 ～6 个单克隆菌落接种于5 mL LB 液体培养基，37 ℃，220 r/min振荡过夜。按1∶50 ～100 比例将上述菌液接种到100 mL LB 培养基，37 ℃，220 r/min 摇菌5 ～6 h，将菌液置冰上冷却，4 ℃、4 000 r/min 离心10 min，回收菌体，加入预冷的0.1mol/L CaCl2重悬，再4℃，4 000 r/min 离心10 min，回收沉淀，向细胞沉淀中加入冰上预冷的含15%甘油的CaCl2溶液重悬，分装，放入-80 ℃保存备用。

1.2.4 pLKO.1-HDAC2-shRNA 质粒构建 将各组退火后的双链Oligo DNA 片段与线性化pLKO.1-puro 干扰载体进行连接，连接体系:双链Oligo DNA 2 μL，线性化pLKO.1-puro 20 ng，10×NEB T4 DNA ligase buffer 2 μL，加ddH2O 至19 μL，在1μL T4 DNA 连接酶的作用下于16 ℃连接过夜;连接产物转化大肠埃希菌stbl2 感受态细胞，-80 ℃取出100 uL/支stbl2 感受态细胞置冰上融化，各组分别加入9 μL 连接产物，冰上静置30 min，42 ℃热激90 s，迅速冰浴3 min，然后加入891 uL LB 液体培养基，37 ℃，200 r/min 振荡培养1 h。待细菌复苏后离心取沉淀涂布含100 mg/L 氨苄青霉素(Amp)的LB 平板，37 ℃正置培养30 min，待平板上液体完全吸收，然后倒置培养过夜。

1.2.5 重组质粒筛选与鉴定 线性化pLKO.1-puro 与目的基因shRNA 序列连接转染大肠杆菌stbl2 感受态细胞，挑选5 个单克隆菌落接种到含100 mg/LAmp 的LB 培养基，37 ℃，200 r/min 振荡培养16 ～18 h。提取重组质粒载体分别进行XhoI、EcoRI 单酶切验证。酶切反应条件为重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 10 μL，XhoI 或EcoR I 1 μL，Buffer 5 μL，加ddH2O 至50 μL，置37 ℃孵育2 h，70 ℃、15 min 终止反应，pLKO.1-puro 质粒采用AgeI、EcoRI 酶切，重组质粒经EcoRI，pLKO.1-HDAC2-shRNA 经XhoI 单酶切验证，酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，pLKO.1-puro 质粒可见7 kb 和1.9 kb 两条特异性条带，重组质粒经EcoRI 后可见1 条约7 kb 特异性条带，pLKO.1-HDAC2-shRNA 经XhoI 单酶切后可见6 567 bp、295 bp、190 bp 及39 bp 的4 条特异性条带，提示外源序列插入成功。挑取酶切鉴定证实为阳性克隆的重组质粒菌液送上海Invitrogen 公司进行DNA 测序鉴定。对测序正确序列的克隆进行扩大培养，采用无内毒素质粒大提试剂盒抽提质粒，并用紫外分光光度计测定浓度及纯度，分装，-20 ℃保存。

2 结果

2.1 寡核苷酸退火产物的鉴定

将3 组针对HDAC2 基因靶点特异性shRNA及阴性对照退火后行4%琼脂糖凝胶电泳，结果在60 bp 处可见目的条带，与预期相对分子大小相符，说明干扰片段退火成功，见图1。

2.2 重组质粒酶切鉴定

pLKO.1-puro 质粒经AgeI、EcoRI 酶切后经琼脂糖凝胶电泳得到7 kb 和1.9 kb 两条特异性条带，见图2;pLKO.1-puro 骨架经凝胶回收后电泳可见7 kb 目的条带，见图3。重组质粒经EcoRI 单酶切后可见1 条约7 kb 大小的目的条带，见图4;pLKO.1-HDAC2-shRNA 通过XhoI 单酶切可见6 567 bp、295 bp、190 bp 及39 bp 的4 条目的片段，见图5;提示外源序列插入成功。

图1 HDAC2-shRNA 寡核苷酸退火产物Fig.1 Mapping of HDAC2-shRNA oligonucleotide annealed product

图2 慢病毒载体pLKO.1-puro AgeI与EcoRI 单双酶切鉴定图Fig.2 Enzyme digestion and identification of lentiviral vector pLKO.1-puro by AgeI and EcoRI

图3 pLKO.1-puro 凝胶回收大片段电泳图Fig.3 Recovered large fragment of pLKO.1-puro by gel electrophoresis

图4 重组慢病毒载体pLKO.1-HDAC2-shRNA的EcoRI 酶切鉴定图Fig.4 Enzyme digestion and identification of recombinant plasmid pLKO.1-HDAC2-shRNA by EcoRI

2.3 重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 测序鉴定

重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 测序结果经BLAST 软件分析，基因HDAC2-shRNA 已成功克隆入慢病毒干扰载体pLKO.1 中，原始序列与已知序列的BLAST 结果完全一致，证实设计序列正确插入载体且无突变(见图6)，表明合成的3 对干扰靶点和阴性对照均已成功构建成重组质粒，符合预期设计。

图5 重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA的XhoI 酶切鉴定图Fig.5 Enzyme digestion and identification of recombinant plasmid pLKO.1-HDAC2-shRNA by XhoI

图6 重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 测序鉴定结果Fig.6 DNA sequence of pLKO.1-HDAC2-shRNA recombinant plasmid

3 讨论

HDAC 是维持组蛋白乙酰化水平的关键酶之一，组蛋白的去乙酰化作用与基因转录抑制密切相关，涉及基因沉默的诸多过程，在肿瘤的发生发展过程中HDAC 起着重要作用［3］，HDAC 通过组蛋白或转录因子等其他蛋白的转录后修饰调节基因转录。正常情况下，机体内组蛋白的乙酰化和去乙酰化处于动态平衡状态，这种平衡的打破将成为癌症产生的直接诱因［3］。组蛋白乙酰化由HDAC 和HATs 两个家族的酶共同调控，当HDAC 过表达或HATs 减少时，在肿瘤细胞中组蛋白大多呈低乙酰化状态，从而导致基因表达的调节异常［4-5］。HDAC2 属于Ⅰ类HDAC，是肿瘤的治疗过程中的一个重要的潜在目标。研究发现，HDAC2 可通过多种机制达到促癌作用，而HDAC2 的敲除可导致某些肿瘤细胞生长停滞和凋亡［6-8］。

RNAi 技术是将内源或外源双链RNA 与细胞内的同源序列mRNA 相结合并使之降解的技术，是一种序列特异性的转录后基因沉默(posttranscriptional gene siliencing，PTGS)，是目前基因功能及基因治疗方面的研究热点［9］。有研究发现，短发夹shRNA 能够增加细胞的转染效率，并能有效敲减目的基因的表达［10］。RNAi 的作用机制是双链RNA 被特异的核酸酶降解，产生小片段的干扰RNA，这些干扰RNA 能与同源的靶RNA 互补结合，使靶RNA 降解，从而导致基因表达受到抑制。该方法具有效应强、持续时间长，在细胞中表达稳定和遗传好等优点，RNAi 研究方法的出现，被广泛应用于基因功能分析等，应用RNAi 技术沉默靶基因的表达，有助于进行靶基因功能以及靶基因下游相关基因等研究［2］。本实验选择慢病毒表达质粒载体pLKO.1-puro，构建能够表达shRNA 的真核表达载体，此载体含有U6 启动子和转录终止信号poly(T)。质粒转染细胞后，在U6 启动子作用下转录出单链RNA，从而折叠形成特异性的短发夹结构(shRNA)，在细胞内进一步加工成siRNA，发挥长期的RNA 干扰效应。该质粒载体含有Amp抗性基因以便筛选克隆菌株，使其能够在含有Amp 的LB 培养基中大量扩增获取重组质粒;在载体结构上存在嘌呤霉素抗性基因，在进行慢病毒感染筛选时，以获得带有目的基因的稳定细胞株。

在本研究中，首先设计针对HDAC2 靶点特异性的寡核苷酸序列，采用基因重组技术将shRNA序列插入线性化的慢病毒表达载体pLKO.1-puro中，实验结果表明，对阳性克隆经酶切鉴定及基因测序验证均证明插入序列完全符合预期结果，没有碱基缺失或替换，成功构建了3 条pLKO.1-HDAC2-shRNA 干扰质粒载体和一条阴性对照载体，为后续HDAC2 基因的相关实验研究奠定了基础。

［1］Wang SS，Li XM，Parra M，et al.Control of endothelial cell proliferation and migrationby VEGF signaling to histone deacetylase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008(22):7738-7743.

［2］王继峰.RNAi 基因沉默技术［J］.中国生物化学与分子生物学会中医药专业委员会年年会文集，2005(1):29-37.

［3］Krämer OH.HDAC2:a critical factor in health and disease［J］.Trends Pharmacol Sci，2009(12):647-655.

［4］Hayashi A，Horiuehi A，Kikuchi N，et al.Type-specific roles of histone deacetylaseHDAC overexpression in ovarian carcinoma:HDAC1 enhances cell proliferation and HDAC3 stimulates cell migration with down-regulation of E-cadherin［J］.Int J Cancer，2010(6):1332-1346.

［5］Liu T，Xu F，Du X，et al.Establishment and characterization of multidrug resistant，prostate carcinoma-initiating stem like cells from human prostate cancer cell lines 22RV［J］.Mol Cell Biochem，2010(12):265-273.

［6］Zhu P，Martin E，Menqwasser J，et al.Induction ofHDAC2 expression upon loss of APC in colorectal tumorigenesis［J］.Cancer Cell，2004(5):455-463.

［7］Fritsche P，Seidler B，Schüler S，et al.HDAC2 mediates therapeutic resistance of pancreatic cancer cells via the BH3-only protein NOXA［J］.Gut，2009(10):1399-1409.

［8］Ropero S，Ballestar E，Alaminos M，et al.Transforming pathways unleashed by a HDAC2 mutation in human cancer.Oncogene，2008(27):4008-4012.

［9］Ashihara E，Kawata E，Maekawa.Future prospect of RNA interference for cancer therapies［J］.Curr Drug Targets，2010(3):345-360.

［10］蔡明俊，雷霆，郭东生.RNA 干扰技术在胶质瘤治疗中的应用［J］.中国临床神经外科杂志，2007(5):319-321.