桑杞脑康颗粒改善转基因果蝇阿尔茨海默病模型学习记忆作用研究

杨巧巧，卿玉玲，桑 勤，赵嘉将，秦少容(.太极医药研究院，重庆 4047；.太极集团有限公司，重庆 4047)



桑杞脑康颗粒改善转基因果蝇阿尔茨海默病模型学习记忆作用研究

杨巧巧1，卿玉玲1，桑 勤1，赵嘉将1，秦少容2
(1.太极医药研究院，重庆 401147；2.太极集团有限公司，重庆 401147)

目的：观察桑杞脑康颗粒对于阿尔茨海默(AD)果蝇模型学习记忆能力的影响。方法：采用Gal4/USA系统建立Aβ42果蝇模型；连续给药后利用巴普洛夫嗅觉学习实验观察桑杞脑康颗粒对AD果蝇行为的影响。结果：桑杞脑康浸膏1.72mg/mL、0.172 mg/mL干预剂量可以显著改善Aβ42果蝇的学习能力(P<0.001)，与临床上用于治疗AD的美金刚效果相当(P>0.05)。结论：桑杞脑康颗粒具有显著改善Aβ42引起的AD果蝇学习缺陷的作用。

桑杞脑康颗粒；阿尔茨海默病；Aβ42蛋白；果蝇

桑杞脑康颗粒是太极集团的独家专利产品(国药准字B20050062),由桑椹、枸杞子、鹿茸、槐花、川芎5味中药组成[1]，具有补养肝肾、健脑、益气、活血功效，临床用于老年肝肾阴虚、血瘀所致的腰膝酸软、神倦乏力、记忆力减退、智能下降病情较轻者。本研究利用巴普洛夫嗅觉学习实验观察该药对阿尔茨海默病(Alzheiemer’s Disease，AD)果蝇模型学习记忆的作用,为桑杞脑康颗粒临床用于治疗AD提供药理研究基础。

1 材料与仪器

1.1 动物

果蝇品系w1118(isoCJ1)；UAS-Aβ42；elav-GAL4c155均由清华大学钟毅实验室提供。

1.2 试剂

玉米粉(食品级)；蔗糖(分析纯，北京化工厂，批号20090220)；琼脂(细菌学分析级，石狮市环球琼脂工业有限公司)；酒石酸钾钠(福晨化学， 批号20130620)；无水氯化钙(北京现代东方精细化学品有限公司，批号20120302)；二甲基亚砜(DMSO)(Sigma 美国)。

1.3 药物

桑杞脑康颗粒浸膏(太极医药研究院提供，含生药1.701g/g)；美金刚(memantine)(Sigma美国)。

1.4 仪器

行为自动化系统由卓凯组装设计(自制)；行为刺激器(S48 Stimulator 美国GRASS Technologies)；温湿度控制器(JotonTmaster变频控制器，法国)。

2 方法

2.1 实验环境控制

饲养和繁殖均在恒温24℃、恒湿42% RH(Relative humidity)的蝇房；给药期间在28℃恒温、42%恒湿的保温箱内饲养；测试在恒温25℃、恒湿70%，避光的行为房中进行。

2.2 AD果蝇模型建立

w1118(isoCJ1) 作为实验的对照组背景果蝇，为方便起见在报告中用“2U”代表。致病性 Aβ42蛋白 (UAS-Aβ42;referred as H29.3)通过杂交在全脑表达的启动子Gal4 line,elav-GAL4c155 (P35)与携带Aβ42的UAS品系获得。因此对照组果蝇和疾病组果蝇通过图1、图2所示杂交获得，本研究所用果蝇均为雄性[2]。

图1 对照组果蝇杂交

图2 疾病组果蝇杂交

2.3 分组

①野生型对照组[w1118(isoCJ1),2U]；②遗传背景对照组(2U*H29.3)；③ Aβ42疾病对照组：P35*H29.3；④阳性药物对照组(喂美金刚100μM， PC)；⑤桑芪脑康高剂量组(SQNK1)；⑥桑芪脑康低剂量组(SQNK2)。

2.4 给药

SQNK1的母液浓度是由100%DMSO配置浸膏 172mg/mL，而SQNK2是用100%DMSO再稀释SQNK1 10倍。在配制工作液时，利用含有4%的蔗糖水将各个母液稀释100倍。因此，SQNK1的工作液浓度为1.72mg/mL，SQNK2的工作液浓度为0.172mg/mL。另外，对照组果蝇喂含有1%DMSO的蔗糖水。果蝇羽化后的第1天将对照组果蝇及疾病组果蝇和待喂药组果蝇通过二氧化碳麻醉后，挑选正确性状的果蝇在含有食物的玻璃管中。所喂药物在挑蝇第2天配制并与配制当天给果蝇喂药。每日果蝇喂药4h，从挑出果蝇的第2天一直喂药至第8天。

2.4 巴普洛夫嗅觉学习测试[3-4]

实验在恒温25℃、恒湿70%避光的行为房中进行[3]。在训练阶段，将100只左右的果蝇装入安置有铜网交叉电极的训练管，先后通入3-辛醇(3-octanol，OCT，Fluka)和4-甲基环己醇(4-methylcyclohexanol，MCH，Fluka)两种气味各60s，中间间隔45s的新鲜空气。在通入第1种气味(condition stimulus,CS+)的同时给予果蝇60V的脉冲电击刺激(US，脉冲时长1.5s，间隔3.5s)。通入第2种气味(CS-)时不给予电击。如此完成1个训练周期。

完成1个训练周期的果蝇被立即转移到T-Maze的选择点，同时从相对的两个方向通入CS+和CS-。经过2min的选择后两侧的果蝇被分别收集，麻醉或处死后进行计数。

分别使用OCT和MCH作为CS+进行训练和测试，得到的两个PI的平均值作为一次实验的PI值使用。PI=0表示测试中果蝇对于两种气味的选择为50∶50，即没有形成记忆；PI=100表示测试中果蝇全部逃避伴随电击的气味，即完美记忆。行为指数(Performance index，PI)的计算公式为：PI=[(CS-)-(CS+)]/[(CS-)+(CS+)]×100。

在每次实验前，测试操作者将首先利用野生型w1118果蝇测试系统运行，只有野生果蝇的短时记忆达到70以上，才认为测试系统正常可以进行后面的测试。为了避免测试者因知道测试药物的果蝇顺序而造成误差，本实验采用双盲模式，即测试者不知道所测药物及其喂药顺序。

3 结果

3.1 Aβ42果蝇存在学习记忆缺陷

给予1%DMSO糖水的各组果蝇，结果显示Aβ42果蝇P35*H29.3组(n=12)PI值较低，表明Aβ42果蝇存在着明显的学习记忆缺陷，与2U(n=6)和2U*H29.3(n=12)对照组比较，差异有显著统计学意义(P<0.001)，表明Aβ42导致了果蝇嗅觉学习记忆的缺陷，见图3。

3.2 桑杞脑康颗粒改善Aβ42果蝇的学习能力

结果显示3个给药组PC(n=12)、SQNK1(n=8)、SQNK2(n=8)的PI值均升高，与Aβ42疾病对照组相比，差异有显著统计学意义(P<0.001),见图3。

注：与Aβ42果蝇相比，###P<0.001；与Aβ42果蝇相比，***P<0.001。

图3 桑杞脑康颗粒对Aβ42果蝇学习能力的影响

4 讨论

AD是常见的痴呆类型，是一种和年龄相关的慢性进行性退行性脑部疾病。临床表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、抽象思维和计算力损害、人格和行为的改变等。目前AD的确切发病机制尚不清楚，相关研究表明中枢胆碱能神经元数量的减少、ACh受体敏感性降低、ACh通路的解剖异常等都可导致学习记忆功能障碍[5]。AD的特征性病理学改变是细胞外淀粉样斑块和细胞内神经纤维结。AD分子机制的研究，揭示了APP的剪切→Aβ的生成→Aβ的沉积→老年斑的形成及其伴随神经元的损伤是AD病理机制的中心环节。Aβ42的聚集性较Aβ40更强，Aβ42是淀粉样斑块的核心成分。

果蝇是进行脊椎动物和非脊椎动物遗传学和细胞生物学研究的一种重要模式生物。从1918年利用果蝇模型研究黑色素沉着细胞瘤以来，绝大部分人类遗传及变性疾病，如肿瘤、神经变性病、睡眠障碍、糖尿病和肥胖症等主要病理改变都在果蝇模型上成功重现[6]。同时，果蝇的生命周期只有10天，提供了短时间内对AD病变全过程进行研究的可能[7]。

本研究选用的是一种表达人源Aβ42蛋白的UAS品系，以及能在神经细胞中特异性表达Gal4蛋白的elav-GAL4c155品系，只需要将这两种品系的果蝇进行一次杂交，就可以在子代果蝇神经细胞中大量表达人源Aβ42。已有研究表明，这种Aβ42果蝇表现出明显的年龄依赖性的短时记忆能力缺陷、寡聚体和纤维化沉积和显著的神经元凋亡[8-9]。本研究采用的Aβ42果蝇，与野生型和遗传背景对照组相比，也表现出学习能力的缺陷(P<0.001)。

本研究采用果蝇巴普洛夫嗅觉逃避条件反射范式检测果蝇认知功能的水平，该行为范式在果蝇行为学研究领域已被广泛使用，是经典的检测果蝇联想学习记忆能力的方法[3]。AD患者最先表现出的认知功能缺陷是对于新记忆形成的障碍，所以本研究以单词训练后产生的学习能力(又称为瞬时记忆)作为检测指标。

在本研究中，给予转基因AD果蝇模型桑杞脑康浸膏1.72mg/mL、0.172 mg/mL干预剂量可以显著改善Aβ42果蝇的学习能力(P<0.001)，与临床上用于治疗AD的美金刚效果相当(P>0.05)。同时本实验采用双盲模式，即测试者不知道所测药物及其喂药顺序，降低了实验系统误差。

利用AD转基因果蝇，初步证明了桑杞脑康颗粒具有改善转基因果蝇阿尔茨海默病模型学习记忆的作用。AD发病机制复杂，多种致病机制相互作用，中药多成分多靶点起效，桑杞脑康颗粒补肝肾、健脑，用于治疗老年痴呆的作用机制还需要在更高级的哺乳动物模型上进一步验证[10]，为临床用药提供药理研究基础。

[1] 重庆大易科技投资有限公司.一种药物组合物及其制备方法和质量控制方法[P].中国专利:2005100707352,2006 -11- 22.

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(责任编辑：宋勇刚)

Effects of Sangqi Naokang Granules on the Learning and Memory Ability of Transgenic Alzheimer’s Disease of Drosophila Model

Yang Qiaoqiao1,Qing Yuling1,Sang Qin1,Zhao Jiaojiang1,Qin Shaorong2
(1.Taiji Pharmacetical Research Institute,Chongqing 408000,China；2.Taiji Group，Chongqing 401147,China)

Objective:To observe the effect of Sangqi Naokang Granules on the Learning and Memory Ability of Transgenic Alzheimer’s Disease of Drosophila Model.Methods:With an extensively characterized Pavlovian olfactory aversive conditioning,the effect of feeding Sangqi Naokang in Aβ42-expressing drosophila operated by Gal4/USA system was probed.Results:1.72mg/mL、0.172 mg/mL Sangqi Naokang Extract can significantly Improve the learning and memory ability of Transgenic Alzheimer’s Disease of Drosophila Model(P<0.001).Conclusion:Sangqi Naokang Granules can significantly rescue the learning and memory loss induced by Aβ42.

Sangqi Naokang Granules; Alzheimer’s Disease; Aβ42; Drosophila

2015-03-17

杨巧巧(1971-)，女，硕士，太极医药研究院高级工程师，研究方向为中药新药项目引进和研发。E-mail：qiaoqiaoyangtaiji@163.com

R285.5

A

1673-2197(2015)15-0017-03

10.11954/ytctyy.201515006