HPLC法测定白背叶中大波斯菊苷含量

谢 巍，蒋受军，2*

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西玉林食品药品检验所， 广西 玉林 537000)



HPLC法测定白背叶中大波斯菊苷含量

谢 巍1，蒋受军1，2*

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西玉林食品药品检验所， 广西 玉林 537000)

目的：建立高效液相色谱法测定白背叶药材中大波斯菊苷含量的方法。方法：采用Gemini-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，以甲醇-0.1%磷酸水溶液(40∶60)为流动相，柱温:25℃，流速:1.0mL·min-1，检测波长:336nm。结果：大波斯菊苷达到基线分离，在0.04486～0.8972μg范围内线性关系良好(r=0.999 3)，大波斯菊苷平均加样回收率(n=6)为97.67%(RSD=1.94%)。结论：所建立的含量测定方法操作简单、快速、重复性好，可用于白背叶药材的质量控制。

白背叶；大波斯菊苷；HPLC；含量测定

白背叶为大戟科野桐属植物白背叶(Mallotusapelta(Lour.)Muell. Arg.)的干燥叶，又名野芙蓉、白林树、白面虎等，具有健脾化湿、柔肝活血、收敛固脱、消炎止血等功效。主要用于慢性肝炎、肝脾肿大、脱肛、白带、妊娠水肿、耳炎、外伤出血等[1]疾病。在我国主要分布于河南、广西、海南、陕西、云南等地[2]。王志萍等[3-5]研究表明白背叶有一定的保肝、抗肿瘤、抗菌、止血等药理作用。经查阅有关文献资料, 国内外已有对白背叶中化学成分研究的报道[6-8]。大波斯菊苷具有较强的抑制肿瘤细胞作用[9]，提示其可能为白背叶药材所具功效的活性成分。本实验建立了HPLC测定白背叶药材中大波斯菊苷含量的方法，以期为建立全面合理的白背叶药材质量控制标准奠定基础。

1 仪器与试药

UltiMate 3000 高效液相色谱仪(Thermo Scientific)；HH-S6数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；AG-204电子分析天平(METTLER TOLEDO)；Millipore Simplicity-UV超纯水器(美国密里博)。

白背叶由广西金秀圣堂制药有限公司提供, 经广西食品药品检验所韦家福副主任药师鉴定为大戟科植物白背叶(Mallotusapelta(Lour) Muell-Arg)的干燥叶，标本存放于广西食品药品检验所中药标本室。大波斯菊苷对照品自行从白背叶药材中分离、精制而得, 经MS、H1-NMR和13C-NMR确定结构，HPLC峰面积归一化法测得纯度均大于98% 。

水为超纯水，甲醇、乙腈(美国Fisher公司，色谱纯)，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取105℃干燥至恒重的大波斯菊苷22.43mg，置于25mL容量瓶中，加适量70%甲醇水溶液超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含大波斯菊苷0.897 2mg的对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

取白背叶药材粉末(24目)约1.0g，精密称定，精密加入70%甲醇水溶液25mL，称量，加热回流提取1.5h，放冷，用70%甲醇水溶液补足减失的量，滤过，取续滤液经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 色谱条件

采用Gemini-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，以甲醇-0.1%磷酸水溶液(40:60)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，检测波长336nm，柱温25℃，进样量10μL。采用外标法计算含量，理论塔板数以大波斯菊苷计算应不低于10 000，分离度为2.21。色谱见图1。

图1 大波斯菊苷对照品(A)和白背叶药材(B)HPLC色谱(I为大波斯菊苷)

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.1”项下大波斯菊苷对照品溶液(每1mL中含大波斯菊苷0.897 2mg)0.5、1、2、3、5和10mL，分别置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，分别进样10μL，测定峰面积，以大波斯菊苷进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为 Y=1 594.4X-103.75,r=0.999 3，线性范围为0.0448 6～0.897 2μg。

2.5 精密度试验

取白背叶药材粉末(批号011196)约1.0g，精密称定，按“2.2”项下方法制备，进样10μL，连续测定6次，记录峰面积。结果大波斯菊苷峰面积的RSD为0.06%(n=6)，表明所用仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一份白背叶供试品溶液，分别于溶液制备后0、2、4、12、24h进样，测定，记录大波斯菊苷峰面积。结果大波斯菊苷峰面积的RSD分别为0.11%(n=5)，表明24h内供试品溶液稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批白背叶药材粉末6份(批号011196)，每份约1.0g，精密称定，按“2.2”项下方法制备，分别进样10μL，记录峰面积，并计算含量。大波斯菊苷的平均含量为24.594 mg/g，RSD为1.46%，表明该方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称定已测定含量(每1g中含大波斯菊苷24.594mg)的白背叶药材粉末6份，每份约0.5g，精密称定，另精密称大波斯菊苷对照品74.55mg置150mL量瓶中，加适量甲醇超声使其溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。分别在上述6份药材中精密加入混合对照品储备液25mL，按“2.2”项下方法制备，分别进样10μL，记录大波斯菊苷的峰面积，计算含量，并计算回收率。结果见表1。

表1 白背叶药材中大波斯菊苷的回收率试验结果 (n=6)

2.9 样品含量测定

取6批不同批号的白背叶药材粉末，每份约1.0g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样10μL测定，记录大波斯菊苷的峰面积，并计算含量。结果见表2。

表2 白背叶药材中大波斯菊苷的含量测定结果

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的选择

本研究优选了不同提取条件制备供试品溶液，考察了不同提取方法(超声提取、回流提取)、提取时间(30、60、90min)、提取溶剂(甲醇、乙醇和70%甲醇水溶液)、溶剂用量(10、25、50mL)和药材粉碎度(10、24、50目)对白背叶药材中大波斯菊苷提取率的影响。结果表明白背叶药材粉末在(24目)1.0g、加70%甲醇25mL、加热回流提取1.5h的条件下，大波斯菊苷提取率最高。

3.2 色谱条件的选择

曾用甲醇∶水(24∶76)梯度洗脱[7]，发现大波斯菊苷色谱峰的保留时间较长，经过调整流动相及其比例，大波斯菊苷出峰时间比较适中，且峰分离度较好，因此选择甲醇-0.1%磷酸水溶液(40∶60)作流动相。

3.3 结论

本试验建立了HPLC法测定白背叶药材中大波斯菊苷含量的方法，并测定了6批不同来源白背叶药材中大波斯菊苷的含量，结果表明：不同来源白背叶药材中的含量有一定差异性，提示采用多指标定量方法，能更好地控制白背叶药材质量。

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草(第四卷) [M].上海: 上海科学技术出版社, 1999: 827.

[2] 单家林.大戟科植物的地理分布和区系特征[J].热带农业科学,1998(4): 231.

[3] 王志萍，冯桥，沈树虎.白背叶根提取物的体外抑菌试验[J].广西中医药,2012,35(3):55.

[4] 赵进军,吕志平, 王晓东,等.白背叶根在肝纤维化动物模型中抗氧化作用的实验研究[J].中药材,2002,25(3):185.

[5] 郑作文，伦玉宁，赵丽丽.白背叶提取物芹菜素对裸鼠人胃癌细胞移植瘤生长及凋亡的影响[J]. 中国实验方剂学杂志,2012,18(23):214.

[6] 韦松,曲磊,郑作文.白背叶黄酮类化学成分研究[J]. 中成药,2012,34(4):69.

[7] 朱斌,白桂昌, 蒋受军,等.白背叶化学成分和含量测定研究[J].中国中药杂志,2007, 32(10): 932.

[8] 朱斌,蒋受军,林瑞超. GC-MS测定白背叶中的挥发油[J].华西药学杂志,2008,23(1):35.

[9] 黄丽贞,郑作文,唐云丽. 白背叶黄酮化合物 QB3对人肿瘤细胞增殖的抑制作用[J].科学技术与工程,2011,11(22):5394.

(责任编辑：宋勇刚)

HPLC Method for Determination of Apigenin-7-O-glucoside inMallotusapelta

Xie Wei1,Jiang Shoujun1，2*

(1.Guangxi University of Chinese medicine, Nanning 530001, China;2.YuLin Institute for Food and Drug Control,Guangxi 537000, China)

Objective:To establish an HPLC method for determination of Apigenin-7-O-glucoside inMallotusapelta. Methods:HPLC was performed on a Gemini-C18analytical column (4.6mm×250 mm, 5μm) at 25 ℃ with methanol and 0.1% Phosphoric acid (40:60) as the mobile phase.Results:The baseline separation of Apigenin-7-O-glucoside was achieved The linear ranges of 0.04486～0.8972μg (r=0.9990). The average recovery(n=6) was 97.67% (RSD=1.94%).Conclusion:The method of determination is proved to be simple, quick, repeatable, and can be used for quality control ofMallotusapelta.

Mallotusapelta；Apigenin-7-O-glucoside；HPLC；Content

2015-02-05

广西科技创新能力与条件建设项目(桂科攻10124008-15)；广西自然科学基金项目(2010GXNSFA013233)

谢巍(1989-)，男，广西中医药大学硕士研究生，研究方向为食品药品安全性评价。

蒋受军(1969-)，男，广西玉林食品药品检验所主任药师，研究方向为中药化学成分及中药质量控制。E-mail:jiangshoujun@sina.com

R284

A

1673-2197(2015)13-0016-03

10.11954/ytctyy.201513007