川续断不同炮制品中总皂苷及川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ含量测定

彭 丹，杨小林，黄文哲，王振中，肖 伟，杨中林*

(1.中国药科大学 天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009；2.南京中医药大学 江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室，江苏 南京 210023；3.江苏省康缘药业有限公司，江苏 连云港 222002)



川续断不同炮制品中总皂苷及川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ含量测定

彭 丹1，杨小林2，黄文哲3，王振中3，肖 伟3，杨中林1*

(1.中国药科大学 天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009；2.南京中医药大学 江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室，江苏 南京 210023；3.江苏省康缘药业有限公司，江苏 连云港 222002)

目的：考察川续断不同炮制品中总皂苷及川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ含量的变化。方法：川续断不同炮制品分为川续断生品、盐制品及酒制品，利用紫外分光光度法测定各炮制品中总皂苷的含量，高效液相色谱法测定各炮制品中川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ的含量。结果：与续断生品比较，酒制品和盐制品中总皂苷含量有所下降；盐制品中川续断皂苷Ⅵ含量显著增加、川续断皂苷Ⅹ含量显著降低；酒制品中川续断皂苷Ⅵ含量显著增加、川续断皂苷Ⅹ含量略有降低，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论：川续断不同炮制品中总皂苷及川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ的含量明显不同，为川续断不同炮制品质量标准制订提供参考。

川续断；炮制品；总皂苷；川续断皂苷Ⅵ；川续断皂苷Ⅹ；含量测定

续断为川续断科植物川续断DipsacusasperWall.ex Henry的干燥根，性苦、辛，微温，归肝、肾经，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏的作用[1]。川续断含有三萜皂苷类、环烯醚萜、生物碱、多糖、挥发油等化学成分[2]。皂苷类是续断的主要有效成分，不同地区含量在2.20%～19.91%之间[3]，具有抗氧化[4]、治疗骨质疏松[5]等药理活性。续断的炮制方法多样，古代炮制方法包括净制、切制、炒制、酒制等，现代炮制方法有酒拌后麸炒、盐拌后麸炒、盐制及制炭等[6]。《中国药典》2010年版收载了两种续断的炮制方法，即酒制和盐制，以川续断皂苷Ⅵ作为续断质量控制的指标性成分。目前尚无同时评价不同炮制方法对川续断总皂苷和川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ含量影响的报道。本实验拟以川续断总皂苷和川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ为评价指标，探讨续断不同炮制方法对川续断总皂苷和川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ含量的影响。

1 材料与仪器

1.1 材料

川续断(产地四川，购自亳州市瑞草中药饮片有限责任公司，经中国药科大学中医药教研室杨中林教授鉴定为川续断科植物川续断DipsacusasperWall.ex Henry的干燥根)；川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ(均为本实验室自制，川续断皂苷Ⅵ的纯度为98.0%，川续断皂苷Ⅹ的纯度为94.9%)；齐墩果酸对照品(购自中国食品药品检定研究院，批号：110709-201206，纯度为94.9%)；黄酒(旦阳牌丹阳黄酒，江苏省丹阳酒厂)；食盐(江苏省盐业集团有限公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)； 香兰素(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；高氯酸(分析纯，金鹿化工有限公司)；冰醋酸(分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司)。

1.2 仪器

BS124S型万分之一电子天平(德国赛多利斯集团)；TB-25型十万分之一电子天平(北京丹佛仪器有限公司)；B-260型恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；752N紫外分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；Agilent 1260型高效液相色谱系统(美国安捷伦公司)，DAD型检测器。

2 方法与结果

2.1 川续断不同炮制品制备

2.1.1 盐制[1]取适量川续断生品，加盐水拌匀，闷置过夜，置炒制容器内，以文火加热，炒至表面黑褐色、味微咸时，取出，放凉，常温下密封保存，备用。盐制时，每100kg待炮制品用食盐2kg。

2.1.2 酒制[1]取适量川续断生品，加黄酒拌匀，闷透，置炒制容器内，用文火炒至表面浅黑色或灰褐色、略有酒香气时，取出，放凉，常温下密封保存，备用。酒制时，每100kg待炮制品用黄酒10～20kg。

2.2 川续断总皂苷含量测定

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取齐墩果酸对照品3.30mg，加甲醇定容至25mL，得0.132mg/mL的标准品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取续断生品粉末0.5g，用20mL 70%乙醇回流提取3次，每次提取时间为1h。将3次提取液合并后滤纸常压过滤，减压浓缩去掉乙醇，浓缩液再加蒸馏水定容至25mL。用石油醚(沸程60～90℃)萃取药材提取浓缩液3次，每次15mL。萃取后水层80℃水浴蒸干，加甲醇溶解定容至50mL。

2.2.3 显色反应 取一定量齐墩果酸对照品溶液或供试品溶液置具塞试管中，80℃水浴挥干溶剂后，精密加入0.2mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸，密塞摇匀，60℃恒温水浴加热15min，取出立即冰水浴5min，加入5mL冰醋酸，摇匀。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL齐墩果酸对照品溶液。0mL设为空白对照组，各组按“2.2.3”项下显色反应显色后，以554nm为测定波长，对照品浓度(C)为横坐标，吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归分析，得回归方程为Y=48.924X+0.024 2，r=0.999 7。结果表明，川续断总皂苷含量在0.81～20.6μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度考察 精密吸取0.5mL齐墩果酸对照品溶液，共5份，按“2.2.3”项下显色反应后，于554nm波长下测定吸光度。川续断总皂苷吸光度RSD值为0.35%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液50μL，共5份，按“2.2.3”项下显色反应后，分别于0、0.5、1、2、4h测定吸光度。川续断总皂苷吸光度RSD值为1.96%，表明供试品溶液在4h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 精密称取适量续断生品细粉，均匀分成5份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，各吸取供试品溶液50μL，按“2.2.3”项下显色反应后，于554nm波长下测定吸光度。川续断总皂苷吸光度RSD值为1.03%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取6份已知含量的续断生品粉末，分别精密加入齐墩果酸对照品溶液，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，各吸取供试品溶液50μL，按“2.2.3”项下显色反应后，于554nm波长下测定吸光度,计算川续断总皂苷加样回收率。川续断总皂苷加样回收率分别为104.7%、99.5%、103.1%、100.5%、104.2%，RSD值为2.21%。

2.2.9 样品含量测定 分别精密称取0.5g不同炮制品粉末，各取3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，各吸取供试品溶液50μL，按“2.2.3”项下显色反应后，于554nm波长下测定吸光度。计算得生品续断、酒续断、盐续断中川续断总皂苷的含量，结果见表1。

2.3 川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Boston Green ODS-AQ (4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈-水(30∶70)，流速为1.0mL/min，检测波长为212nm，进样量为20μL，柱温为30℃。在此色谱条件下，川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ与其相邻组分达到完全分离，分离度大于1.5，峰形对称，两种成分的理论塔板数均不低于5 000，见图1。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称定川续断皂苷Ⅵ对照品6.90mg和川续断皂苷Ⅹ对照品5.25mg，分别加甲醇定容至5mL，制成川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ 各自浓度为1.38、1.05mg/mL的溶液，摇匀，0.45μm有机滤膜过滤，得对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备[1]取续断饮片细粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率100W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

图1 川续断混合对照品及不同炮制品HPLC图谱

2.3.4 线性关系考察 精密吸取“2.3.2”项下对照品溶液，稀释成川续断皂苷Ⅵ质量浓度分别为1.38、1.46、0.732、0.366、0.183、0.092mg/mL，川续断皂苷Ⅹ质量浓度分别为1.05、0.840、0.420、0.210、0.105、0.053mg/mL。按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，以对照品进样浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行线性回归分析。川续断皂苷Ⅵ线性回归方程为Y=2 823.1X-50.047，r=0.999 9，川续断皂苷Ⅹ线性回归方程为Y=1 451.5X-11.203，r=0.999 6。结果表明，川续断皂苷Ⅵ在1.83～0.095mg/mL范围内，川续断皂苷Ⅹ在1.05～0.056mg/mL范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度考察 精密吸取同一供试品溶液20μL，按“2.3.1”项下色谱条件重复进样5次。川续断皂苷Ⅵ、X峰面积的RSD值分别为0.85%、0.57%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、12h精密吸取20μL进样分析。川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ峰面积的RSD值分别为1.30%、0.46%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 精密称取一定量续断饮片细粉，均匀分成5份，分别按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定。川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ浓度的RSD值分别为2.05%、1.24%，表明此方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密称取5份已知含量的续断生品细粉，分别精密加入适量川续断皂苷Ⅵ对照品和川续断皂苷Ⅹ对照品，按“2.3.3 ”项下方法制备供试品溶液，按“3.3.1”项下色谱条件测定，计算川续断皂苷Ⅵ和川续断皂苷Ⅹ各自的加样回收率。川续断皂苷Ⅵ加样回收率分别为98.2%、102.3%、98.2%、96.3%、101.7%，RSD值为2.57%。川续断皂苷Ⅹ加样回收率分别为101.1%、103.1%、103.5%、97.0%、103.6%，RSD值为2.76%。

2.3.9 样品含量测定 分别精密称取约0.5g不同炮制品粉末，每种炮制品各3份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，计算得生品续断、酒续断、盐续断中川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ的含量，结果见表2。

2.4 统计分析

3 结果分析

3.1 川续断不同炮制品中总皂苷含量

与川续断生品相比，川续断酒制品和盐制品中总皂苷含量均有明显下降，且川续断酒制品的总皂苷含量最低，仅为7.98%。详见表1。

3.2 川续断不同炮制品中川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ含量

与川续断生品比较，川续断酒制品和盐制品中川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ含量均有不同程度变化。川续断盐制品的川续断皂苷Ⅵ含量最高，较川续断生品增加36.13%，达到4.71%，而川续断皂苷Ⅹ含量则下降67.13%，仅为0.904%，两者总含量显著下降。川续断酒制品中川续断皂苷Ⅵ含量增加7.51%，川续断皂苷Ⅹ含量下降3.6%，两者总含量略有上升。详见表2。

表1 川续断不同炮制品中总皂苷含量 (n=3)

注：与生品含量比较，▲P<0.05；▲▲P<0.01。

表2 川续断不同炮制品中川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ含量 (n=3)

注：与生品含量比较，▲P<0.05；▲▲P<0.01。

4 讨论

川续断皂苷类是川续断的主要有效成分。川续断皂苷Ⅵ已作为《中国药典》2010年版续断不同炮制品的指标性成分。川续断皂苷Ⅹ是川续断中含量较高的皂苷类成分之一，但尚未纳入《中国药典》作为川续断质量控制的指标性成分。现代研究表明中药化学成分复杂多样，不同炮制品的化学成分及药理作用具有很大差异，仅用一种化学成分作为不同炮制品的质量控制指标性成分难以反映中药的质量。

酒制续断可用于温肾强筋骨，活血化瘀，抗炎镇痛。盐制续断则使其药效下行，强于补肝肾，主治腰膝酸软和消血肿[1,7]。通过对续断生品的不同炮制处理，满足了续断的临床使用需要。本实验结果显示，川续断生品总皂苷含量最高，其酒制品和盐制品的总皂苷含量均有不同程度降低。与川续断生品比较，川续断盐制品的川续断皂苷Ⅵ含量最高，川续断皂苷Ⅹ含量最低。川续断酒制品中川续断皂苷Ⅵ含量显著升高、但不及盐制品。川续断皂苷Ⅹ含量略有下降，但显著高于盐制品。川续断酒制品中川续断皂苷Ⅵ和川续断皂苷Ⅹ总含量位于不同炮制品之首。

综上所述，不同炮制方法对川续断中总皂苷和川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ含量影响显著，且各有不同，揭示了续断不同炮制品物质基础发生了不同的变化，为川续断不同炮制品质量标准制订提供了实验参考。川续断酒制品和盐制品药理作用的不同是否与川续断不同炮制品中总皂苷和川续断皂苷Ⅵ、Ⅹ含量的变化有关，还有待进一步研究。

[1] 中华人民共和国药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社，2010.

[2] 吴春蕾,张志锋,刘圆.川续断科植物的研究进展[J].成都医学院学报,2009，4(1):66-71.

[3] 刘永,卫莹芳,闫婕,等.不同产地续断中总皂苷的含量测定[J].时珍国医国药,2009，20(11):2767-2768.

[4] 路敏,雷宁,吕亚丽,等.续断皂苷类成分的体外抗氧化活性研究[J].北京师范大学学报：自然科学版,2013，49(1):42-45.

[5] 张琪,成砚萍,马博,等.续断总皂苷和三七总皂苷配伍对去卵巢大鼠骨质疏松症的治疗作用[J].中药新药与临床药理,2010，21(5):502-505.

[6] 金奇,来平凡,张云,等.续断炮制历史沿革与现代炮制研究进展[J].中国药业,2010，19(24):11-12.

[7] 辛继兰,赵雅娟.续断及其炮制品的药效学研究[J].中医药学报,2002，30(4):16-17.

(责任编辑：魏 晓)

Quantitative Determination of Total Saponins and Asperosaponin VI,X in the Different Processed Products ofDipsacusAsper

Peng Dan1,Yang Xiaolin2,Huang Wenzhe3,Wang Zhenzhong3,Xiao Wei3,Yang Zhonglin1*

(1.China Pharmaceutical University，State Key Laboratory of Natural Medicines,Nanjing 210009,China;2.Nanjing University Of Chinese Medicine,Key Laboratory of Research and Development of Marine Medicinal Material Resources in Jiangsu Province,Nanjing 210023;3.JiangSu Kanion Pharmaceutical co.ltd.，Lianyungang 222002,China)

Objective:To investigate the content changes of total saponins and asperosaponin VI、X in the different prepared products of Dipsacus asper.Methods:The different prepared products of Dipsacus asper was divided into raw products,salt products and wine products.The experiment adopted UV spectrophotometric to quantitatively analyze of total saponins in the different processed products,and determined the content of asperosaponin VI、X by High Performance Liquid Chromatography.Results:Comparing with in raw product of Dipsacus asper,the content of total saponins remarkably decreased in wine products and salt products; Asperosaponin VI significantly increased,and asperosaponin X evidently decreased in salt products; Asperosaponin VI significantly increased,and tasperosaponin X decreased slightly (P<0.05 orP<0.01)) in wine products.Conclusion:The content of total saponins and asperosaponin VI、X is markedly different in the different processed products of Dipsacus asper,that provided a reference for the quality standard of different processed products of Dipsacus asper.

DipsacusAsper；Processed Products；Total Saponins；Asperosaponin VI；Asperosaponin X；Content Determination

2015-02-25

彭丹(1992-),男，中国药科大学硕士研究生，研究方向为中药制剂。

杨中林(1950-)，女，中国药科大学教授，研究方向为中药制剂。E-mail：yzl1950@126.com

R284

A

1673-2197(2015)13-0034-04

10.11954/ytctyy.201513014