粗叶悬钩子叶子乙醇提取物抑菌效果研究

黄驹辉，黄其春，杨彩丽，檀新珠，何 茜，赵成成

(1.龙岩学院 生命科学学院，福建 龙岩 364012；2.福建农林大学 动物科学学院，福建 福州 350002)



粗叶悬钩子叶子乙醇提取物抑菌效果研究

黄驹辉1,2，黄其春1*，杨彩丽1，檀新珠1，何 茜1，赵成成1

(1.龙岩学院 生命科学学院，福建 龙岩 364012；2.福建农林大学 动物科学学院，福建 福州 350002)

目的：研究粗叶悬钩子叶子乙醇提取物的抑菌效果。方法：以80%乙醇为浸提溶剂，研究粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果。结果：粗叶悬钩子叶子乙醇提取物的最佳提取条件为料液比1∶10，提取时间为1.5h，提取温度为70℃，在此条件下进行抑菌试验，粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌效果，其抑菌圈直径分别为15.50mm、15.82mm和16.48mm，最低抑菌浓度分别为100mg/mL、50mg/mL和50mg/mL。结论：粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有明显的抑菌效果。

粗叶悬钩子叶子；提取物；抑菌效果

粗叶悬钩子(RubusaleaefoliusPoir.)为蔷薇科(Rosaceae)树莓属(RubusL.)植物，又名悬钩子属植物，分布广泛，具有较高的营养和药物价值[1-2]。在民间，粗叶悬钩子的根、叶均可入药，具有活血化瘀、祛风祛湿、清热解毒、止血止痛、固肾涩精等功效。现代医学研究发现，悬钩子属植物具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗过敏、保肝、镇痛等多种作用[2-3]。目前，有关粗叶悬钩子的药理活性研究仅有零星报道，主要集中在抗肝损伤方面[4]，而有关粗叶悬钩子的抗菌作用研究还未见报道。为此，本实验拟以80%乙醇为浸提溶剂，研究粗叶悬钩子叶子乙醇提取物的抑菌效果，旨在为粗叶悬钩子的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 粗叶悬钩子叶子 采自福建省永定县，晒干备用。

1.1.2 供试菌株 大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella sp)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aurreus)，由龙岩学院生命科学学院微生物实验室提供。

1.1.3 培养基 大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌采用牛肉膏蛋白胨培养基。

1.1.4 主要仪器设备 FW80高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)、DK-S24型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)、2XZ-2型旋片式真空泵(临海市谭氏真空设备有限公司)、D2F-6020真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)、LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、SW-CJ-1FD型单人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司)、SHP-150生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物提取条件研究 粗叶悬钩子叶子经粉碎后过筛，取一定质量粉末，以80%乙醇为浸提溶剂，在前期单因素试验的基础上，选取料液比、提取时间、提取温度三个因素的最优试验范围，以提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大小作为指标，通过正交试验确定最佳提取条件。提取液经过滤除渣、弃滤液沉淀物后，置于真空度为0.09MPa(60℃)的真空干燥箱中浓缩，制得粗叶悬钩子叶子乙醇提取物浸膏，4℃保藏备用。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

1.2.2 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物抑菌效果测定 采用纸片法[5]，取直径7mm灭菌滤纸片，放入由最佳提取条件制得的粗叶悬钩子叶子乙醇提取物的浸膏中浸泡12h备用。挑取各供试菌种进行斜面活化后，挑取部分菌落于无菌生理盐水中，制成菌悬液(菌体溶度约为104～105CFU/mL)。取各供试菌悬液0.2mL，涂布于相应的平板中，放置15min后，将已风干的滤纸片贴在平板上，每个平板贴3片，并以生理盐水为对照，每种供试菌重复3次。各供试菌在培养一段时间后，测定滤纸片抑菌圈直径大小(mm)，并参考NCCLS推荐的标准进行判断[6]。以抑菌圈直径>20mm为极敏；抑菌圈直径在15～20mm之间为高敏；抑菌圈直径在10～14mm之间为中敏；抑菌圈直径<10mm为低敏；无抑菌圈为耐药。

1.2.3 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物最低抑菌浓度测定 采用琼脂稀释法[7]，制备粗叶悬钩子叶子乙醇提取物终浓度分别为200、100、50、25、12.5g/mL的平板。取各供试菌悬液100μL，涂布于相应的平板中，放置15min后，培养、观察其生长情况。每个浓度重复3次。另取同一浓度系列，不接种任何菌作为空白对照，以无菌落生长的最低浓度为最低抑菌浓度[8]。

2 结果与分析

2.1 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物提取条件

正交试验结果见表2，正交试验结果方差分析见表3。由表2和表3可知，A(料液比)、B(提取时间)、C(提取温度)三个因素对粗叶悬钩子叶子乙醇提取物抑菌效果的影响顺序从主到次依次为A(料液比)>B(提取时间)>提取温度(C)。由表2中的极差数据R可见，A1值在A内较大，B1值在B内较大，C2值在C内较大，理论上最优水平为A1B1C2。由于A1B1C2不存在于正交试验组合中，需要补做试验，通过3次重复试验测得抑菌圈直径为16.48mm，此结果与正交试验中的A1B2C2(16.26mm)的结果非常接近，因此将粗叶悬钩子叶子乙醇提取物的最佳提取条件确定为A1B2C2，即料液比为1︰10(g/mL)、提取时间为1.5h、提取温度为70℃，此时粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为16.26mm。

表2 正交试验结果

表3 正交试验结果方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.00。

2.2 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物抑菌效果

粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对供试菌的抑菌效果见表4。由表4可知，该提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，其次是沙门氏菌、大肠杆菌，抑菌圈分别为16.48mm、15.82mm、15.50mm。

表4 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对供试菌的抑菌效果和最低抑菌浓度

2.3 粗叶悬钩子叶子乙醇提取物最低抑菌浓度

粗叶悬钩子乙醇提取物对供试菌的最低抑菌浓度见表4。由表4可知，该提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为100mg/mL、50mg/mL和50mg/mL。

3 讨论

粗叶悬钩子具有较高的营养和药用价值，在我国传统中医药中应用广泛。目前，有关粗叶悬钩子的药理活性研究仅有零星报道，主要集中在抗肝损伤方面[4]，而有关粗叶悬钩子的抗菌作用研究还未见报道。现代药理学研究表明，粗叶悬钩子叶子的化学成分复杂，其活性成分主要包括三萜、黄酮、鞣质、甾醇等化合物[4]，而且这些化合物具有抗菌、杀菌作用[9]。本试验以80%乙醇为浸提溶剂，研究了粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，结果发现，以提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大小作为指标，粗叶悬钩子叶子乙醇提取物的最佳提取条件为料液比1∶10、提取时间1.5h、提取温度70℃。在此条件下进行抑菌试验，粗叶悬钩子叶子乙醇提取物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌效果，其抑菌圈直径分别为15.50mm、15.82mm和16.48mm，最低抑菌浓度分别为100mg/mL、50mg/mL和50mg/mL。因试验选用的菌种较少，有关粗叶悬钩子的抗菌作用还有待于深入研究。

[1] 孙长清,邵小明,王黎明,等.悬钩子属植物的开发利用概述[J].广西植物,2004,24(6):578-582.

[2] 韩 加,刘继文.悬钩子属植物生物学作用研究进展[J].中国野生植物资源,2009,28(2):1-4,49.

[3] 孟祥娟,刘斌,热增才旦,等.悬钩子属植物化学成分及药理活性研究进展[J].天然产物研究与开发,2011,23(4):767-775,778.

[4] 陈旺,吴志生,章靓,等.粗叶悬钩子化学成分及药理作用研究进展[J].亚太传统医药,2009,5(7):141-143.

[5] 张均田.现代药理实验方法[M].北京:北京医科大学协和医科大学联合出版社,1998:1409-1415.

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[7] 沈关心.微生物与免疫学[M].北京:人民卫生出版社,2003:310.

[8] 李焰,杨小燕,林跃鑫,等.银杏叶有效成分提取与抑菌效果研究[J].中国畜牧杂志,2006,42(15):54-56.

[9] 李叶,唐浩国,刘建学.黄酮类化合物抑菌作用的研究进展[J].家产品加工:学刊,2008(12):53-54,69.

(责任编辑：尹晨茹)

2015-01-16

2013年度龙岩学院大学生创新创业训练计划项目

黄驹辉(1990-)，男，龙岩学院硕士研究生，研究方向为预防医学。

黄其春(1969-)，男，博士，龙岩学院教授，研究方向为营养和免疫。

R285

A

1673-2197(2015)10-0036-02

10.11954/ytctyy.201510015