槐米及其不同成分对内皮细胞损伤修复作用比较研究

安金蒙，杨中林*，郑 琢，萧 伟，王振中，黄文哲，丁 岗

(1.中国药科大学 天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009； 2.江苏康缘药业有限公司，江苏 连云港 222002)



槐米及其不同成分对内皮细胞损伤修复作用比较研究

安金蒙1，杨中林1*，郑 琢1，萧 伟2，王振中2，黄文哲2，丁 岗2

(1.中国药科大学 天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009； 2.江苏康缘药业有限公司，江苏 连云港 222002)

目的：比较研究芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物对高糖诱导的内皮细胞损伤的修复作用。方法：采用含有33mmol·L-1葡萄糖和1%FBS的DMEM低糖培养基处理人脐静脉HUVEC内皮细胞，建立细胞损伤模型，采用NO试剂盒检测各样品对模型内皮细胞NO分泌量的影响；采用MTT法测定细胞活力。结果：芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物均可不同程度地升高模型HUVEC内皮细胞NO分泌量，不同程度地增强细胞活力。结论：芦丁和槲皮素可能为槐米修复内皮细胞损伤的活性成分。

芦丁；槲皮素；槐米黄酮部位；槐米药材提取物；内皮细胞损伤修复

槐米(Sophorae flos)为豆科植物槐SophoarjaponicaL.的干燥花蕾，性苦，微寒。归肝、大肠经，凉血止血，清肝泻火，用于便血、痔血、肝热目赤、头痛眩晕等证的治疗[1]，《神农本草经》将其列为上品。糖尿病是临床最常见的慢性疾病之一，研究报道，芦丁可通过抑制AGEs形成、改善链脲霉素诱导糖尿病大鼠氧化应激状态、改善血糖平衡等发挥治疗糖尿病的作用[2-3]；槲皮素可修复内皮细胞损伤，有效发挥抗动脉粥样硬化作用[4-6]。槐米主要含芦丁及檞皮素等[7]有效成分，故推测槐米可在糖尿病治疗方面发挥一定作用，而槐米及其不同成分对内皮细胞损伤修复作用比较研究未见详细报道。本次实验采用高浓度葡萄糖诱导人脐静脉HUVEC内皮细胞建立细胞损伤模型，以模型内皮细胞NO分泌量和细胞活力为指标，比较研究芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物对内皮细胞损伤的修复作用，为进一步开发利用中药槐米提供实验依据。

1 材料与试剂

1.1 细胞

人脐静脉HUVEC内皮细胞(中国药科大学国家新药筛选中心惠赠)。

1.2 试药与试剂

槐米药材(购自安徽亳州，经作者鉴定为豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花蕾)；一氧化氮试剂盒(南京建成生物工程研究所)；DMEM培养基(批号：914292，Gibco公司)；D-葡萄糖(Amresco, USA)；胰蛋白酶(批号：27250018，Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；二甲基亚砜(分析纯，南京化学试剂有限公司)。

1.3 仪器与设备

Forma311系列直热式CO2培养箱(Thermo Electron Corporation,USA)；超净工作台(苏州艾可林净化设备有限公司)；COIC XDS-1B倒置光学显微镜(重庆光电仪器有限公司)；Spectra Max Plus 384酶标仪(Molecular Devices公司)；TB-25型十万分之一电子天平(Sartorius, USA)；PB-10型酸度计(Sartorius, USA)；YXQ·SG41·280型电热手提压力蒸汽消毒器(上海华线医用核子仪器有限公司)；79-1型磁力搅拌器(深圳国华仪器有限公司)；0412-1型低速离心机(上海医疗器械有限公司)；微量移液器(Thermo ELectron Corporation，USA)大龙；96孔细胞培养板(Caster公司)。

2 方法

2.1 槐米药材提取物与槐米黄酮部位制备

2.1.1 槐米药材提取物制备 托盘天平称取50g槐米药材，置于1L圆底烧瓶中，加12倍量50%的乙醇，密封，浸泡2h，85℃回流提取2h，趁热过32层纱布，同法再提取2次，合并3次滤液，减压浓缩至无醇味，于水浴锅上蒸至浸膏(90℃)，于50℃减压干燥至恒重，称定所得固形物重量为28.450 1g，槐米药材提取物得率=醇提取称量/药材称量×100%=28.450 1/50×100%=56.9%。经HPLC法测定，槐米药材提取物中芦丁含量为24.2%，槲皮素含量为1.05%。

2.1.2 槐米黄酮部位制备 实验室采用碱溶酸沉法分离纯化制得槐米黄酮部位，药材中该部位得率为12.8%，经HPLC法测定，该部位中芦丁含量为91.1%，槲皮素含量为4.58%。

2.2 试药配制

2.2.1 造模剂配制 取已制得的DMEM低糖培养基500mL，加入D-葡萄糖2.466 0g，磁力搅拌1h，得到葡萄糖浓度为33mmol·L-1的DMEM培养基，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，密封保存备用。

2.2.2 阳性药羟苯磺酸钙配制 已知每粒羟苯磺酸钙胶囊标示量为500mg，胶囊内容物重量为556mg，精密称取羟苯磺酸钙粉末2.42mg于5mL容量瓶中，DMEM低糖培养基溶解并定容至刻度，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得浓度为436μg·mL-1的羟苯磺酸钙溶液，密封保存备用。

2.2.3 芦丁对照品样品液配制 精密称定芦丁对照品1.07mg，置于5mL容量瓶中， DMEM低糖培养基定容至刻度，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得浓度为214μg·mL-1芦丁对照品母液。分别稀释成浓度为6.69、13.38、26.75、53.5μg·mL-1芦丁对照品样品液，备用。

2.2.4 槲皮素对照品样品液配制 精密称定槲皮素对照品1mg，置于5mL容量瓶中， DMEM低糖培养基定容至刻度，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得浓度为200μg·mL-1槲皮素对照品母液。稀释成浓度为25.00μg·mL-1槲皮素对照品样品液，备用。

2.2.5 槐米黄酮部位样品液配制 精密称定1.47mg槐米黄酮部位于5mL容量瓶中，DMEM低糖培养基定容至刻度，以0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得芦丁浓度为267.8μg·mL-1、槲皮素浓度为13.6μg·mL-1的槐米黄酮部位样品母液。稀释成芦丁浓度为26.78μg·mL-1、槲皮素浓度为1.36μg·mL-1的槐米黄酮部位样品液，备用。

2.2.6 槐米药材提取物样品液配制 精密称定1.20mg槐米药材提取物于5mL容量瓶中， DMEM低糖培养基定容，以0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得芦丁浓度为58.08μg·mL-1、槲皮素浓度为2.52μg·mL-1的槐米药材样品母液。稀释成芦丁浓度为29.04μg·mL-1、槲皮素浓度为1.26μg·mL-1的槐米药材样品液，备用。

2.3 细胞给药浓度确定

2.3.1 细胞培养与分组 HUVEC细胞在含10%FBS、100μg·mL-1青霉素及100μg·mL-1链霉素的DMEM低糖培养基中，置于5%CO2、37℃饱和湿度空气培养箱中孵育，每2～3天传代1次。

实验时，将细胞稀释至3×104个·mL-1，接种于96孔板中，每孔接种200μL，待细胞生长至80%～90%融合时，换用葡萄糖浓度为33mmol·L-1且含有1%FBS的DMEM培养基同步培养24h，后将细胞随机分为7组，每组设6个复孔：①空白对照组：200μLDMEM低糖培养基；②模型组：180μL造模剂、20μLDMEM低糖培养基；③阳性药组：180μL造模剂、20μL阳性药液；④53.5μg·mL-1芦丁对照品样品液：180μL造模剂、20μL药液；⑤ 26.75μg·mL-1芦丁对照品样品液：180μL造模剂、20μL药液；⑥13.38μg·mL-1芦丁对照品样品液：180μL造模剂、20μL药液；⑦6.69μg·mL-1芦丁对照品样品液：180μL造模剂、20μL药液。

2.3.2 NO分泌量测定 NO分泌量用NO试剂盒进行测定。NO在生理溶液中不稳定，大部分NO快速代谢成亚硝酸盐NO2-和NO3-。本试剂盒采用硝酸还原酶特异性的将NO3-还原为NO2-，NO2-与显色剂作用生成有色物质，用比色法测定NO2-浓度即代表NO水平。

将加药后的96孔板培养72h后，每孔取100μL含药培养液于相应Ep管中，用按照NO试剂盒说明书操作，于550nm下检测每孔的吸光值。

2.3.3 细胞活力测定 用MTT法进行测定。按照“2.3.1”项下方法培养72h后，移除培养液，每孔加入180μL新培养基和20μLMTT溶液(5g·L-1)，孵育4h后吸出上清液，每孔加入200μL DMSO，轻轻震荡10min，待蓝紫色结晶完全溶解后，用酶联免疫检测仪在570nm条件下测各孔吸光度值。

2.4 芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物对高糖诱导的内皮细胞损伤修复作用比较

实验时，将细胞稀释至3×104个·mL-1，接种于96孔板中，每孔接种200μL，待细胞生长至80%～90%融合时，换用葡萄糖浓度为33mmol·L-1且含有1%FBS的DMEM培养基同步培养24h，后将细胞随机分为7组，每组设6个复孔：①空白对照组：200μLDMEM低糖培养基；②模型组：180μL造模剂、20μL DMEM低糖培养基；③阳性药组：180μL造模剂、20μL阳性药液；④26.75μg·mL-1芦丁对照品样品液：180μL造模剂、20μL药液；⑤25.00μg·mL-1槲皮素对照品样品液：180μL造模剂、20μL药液；⑥芦丁浓度29.04μg·mL-1槐米药材提取物样品液：180μL造模剂、20μL药液；⑦芦丁浓度26.78μg·mL-1槐米黄酮部位样品液：180μL造模剂、20μL药液。

将加药后的96孔板继续培养72h，参照“2.3.2”项、“2.3.3”项下方法，测定模型细胞NO分泌量及细胞活力。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 给药浓度确定

NO分泌量采用NO试剂盒进行测定。结果显示，造模组NO含量降低，且与空白组做t检验的P值<0.01，说明高糖诱导的HUVEC内皮细胞损伤模型造模成功。当用高糖处理72h后，NO分泌量将为空白组的53.28%，而给予不同浓度的芦丁对照品样品液后，能够不同程度地抑制高糖诱导的NO分泌量降低，NO分别恢复到空白组的66.39%、63.93%和57.38%，且呈剂量依赖性关系，浓度为26.75μg·mL-1时的作用优于阳性药强苯磺酸钙。但当浓度为6.69μg·mL-1时，与模型组做t检验的P值>0.05，说明6.69μg·mL-1的芦丁对照品样品液已无明显修复内皮细胞作用。具体结果见表1。

表1 不同浓度芦丁对照品样品液对内皮细胞损伤NO分泌量的影响 (±s，n=6)

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

细胞活力采用MTT法进行测定。结果显示，芦丁对照品样品液浓度在26.75μg·mL-1以上时，细胞出现死亡，说明给药浓度过大，产生了一定的细胞毒性。当用高糖处理72h后，细胞活力降低至74.44%，给予不同浓度的芦丁对照品样品液后，能够剂量依赖性增长细胞活力。具体结果见表2。

表2 不同浓度芦丁对照品对内皮细胞损伤模型细胞活力的影响 (±s，n=6)

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

以NO分泌量和对细胞活力的影响为指标，将芦丁对照品给药浓度确定为26.75μg·mL-1，为使研究结果具有比较意义，槐米黄酮部位和槐米药材提取物根据其芦丁含量统一成同等芦丁对照品浓度给药，槲皮素对照品给药浓度与芦丁对照品一致。

3.2 芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物对高糖诱导的内皮细胞损伤修复作用比较

3.2.1 芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物对内皮细胞损伤NO分泌量的影响 NO分泌量用NO试剂盒进行测定。结果显示，造模组NO含量降低，且与空白组做t检验的P值<0.01，说明高糖诱导的内皮细胞损伤模型造模成功。当用高糖处理72h后，NO分泌量相比空白组降低，而给予不同样品时，可不同程度地抑制NO分泌量降低，且除芦丁组外，槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物抑制NO分泌量降低的程度均优于阳性药强苯磺酸钙。具体结果见表3。

表3 芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物对内皮细胞损伤NO分泌量的影响 (±s，n=6)

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2.2 芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物对内皮细胞损伤细胞活力的影响 细胞活力采用MTT法进行测定。结果显示，模型组与空白组比较有极显著性差异，说明内皮细胞损伤模型造模成功。当用高糖处理72h后，细胞活力降低，给予不同样品时，芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物可不同程度地增强细胞活力。具体结果见表4。

表4 芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物对内皮细胞损伤模型细胞活力的影响 (±s，n=6)

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

文献表明[8-9]，NO具有松弛血管平滑肌、抗血小板聚集的作用，可减轻氧自由基造成的血管内皮功能障碍。槲皮素可通过维持一氧化氮(NO)和内皮素-1(Endothelin-1，ET-1)的动态平衡，对内皮细胞损伤有一定修复作用。本次研究用高浓度葡萄糖诱导人脐静脉HUVEC内皮细胞损伤，以模型HUVEC内皮细胞NO分泌量和细胞活力为指标，比较研究芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物对内皮细胞损伤的修复作用，方法简单，稳定可靠。

本次研究表明，芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物对HUVEC内皮细胞损伤均有一定的修复作用，可不同程度地抑制模型HUVEC内皮细胞NO分泌量的降低，不同程度地增强模型内皮细胞活力，说明芦丁和槲皮素均为槐米药材中修复HUVEC内皮细胞损伤的活性成分，且槲皮素对HUVEC内皮细胞损伤的修复作用强于芦丁；选定给药浓度实验时，该浓度下槐米黄酮部位和槐米药材提取物中芦丁的含量分别为26.78μg·mL-1和29.04μg·mL-1，槲皮素含量分别为1.36μg·mL-1和1.26μg·mL-1，芦丁和槲皮素含量相差无几，而槐米黄酮部位修复HUVEC内皮细胞损伤的作用强于槐米药材提取物，提示槐米药材提取物中可能存在其他成分对芦丁和槲皮素修复HUVEC内皮细胞损伤产生了拮抗作用，说明对槐米药材提取物进行富集得到的槐米黄酮部位具有一定的实际价值；统一芦丁浓度给药时，槐米黄酮部位和槐米药材提取物对HUVEC内皮细胞损伤的修复作用均强于芦丁，且槐米黄酮部位和槐米药材提取物中主要成分为芦丁和槲皮素，提示槲皮和芦丁可能产生了协同作用。

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[3] STANELY MAINZEN PRINCE P, KANNAN NK .Protective effect of rutin on lipids, lipoproteins, lipid-metabolizing enzymes and glycoproteins in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Journal of Pharmacy and Pharmacology,2006,58(10):1373-1383.

[4] 李晓龙.槲皮素对高糖环境下人脐静脉内皮细胞活性以及MPP-2与MPP-9表达的影响[D].石家庄:河北医科大学,2014:1-47.

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(责任编辑：尹晨茹)

Protective Effects of Different Components in Sophorae flos on High Glucose-induced Injury in Human Umbilical Vein Endothelial Cell

An Jinmeng1,Yang Zhonglin1*,Zheng Zhuo1,Xiao Wei2,Wang Zhengzhong2,Huang Wenzhe2,Ding Gang2

(1.State Key laboratory of Natural Products and Functions, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China;2.Kanion Pharmaceutical Co. Ltd.,Nanjing 222002, China)

Objective:To evaluate the protective effects of rutin, quercetin,Flavonoids compounds of Sophorae flos, extract of Sophorae flos on the injured human umbilical vein endothelial cell. Methods:High glucose-induced injury in human umbilical vein endothelial cell, determine cell survival viability by MTT, determine the NO produced in cell supernatant by means of nitrate reductase method. Results:A certain concentration of rutin, quercetin,Flavonoids compounds of Sophorae flos, extract of Sophorae flos can enhance the activity of cell under high glucose condition, inhibit the recession of NO.Conclusion:Rutin and quercetin could be the active ingredient of Sophorae flos.

Rutin; Quercetin; Flavonoids Compounds of Sophorae flos;Extract of Sophorae flos; Human Umbilical Vein Endothelial Cell

2014-12-22

安金蒙(1991-)，女，中国药科大学硕士研究生，研究方向为中药制剂学。E-mail：anjinmengcpu@126.com

杨中林(1950-)，女，中国药科大学教授，博士生导师，研究方向为中药炮制与中药制剂。E-mail：YZL1950@126.com

R285.5

A

1673-2197(2015)10-0027-04

10.11954/ytctyy.201510012