百宝丹喷雾剂微生物限度检查方法学验证

赵加强,周荣光,*,杨兆祥,李翠娥，高宏涛

(1.昆明制药集团股份有限公司，云南 昆明 650100； 2.昆明医科大学，云南 昆明 650500)



百宝丹喷雾剂微生物限度检查方法学验证

赵加强1,周荣光1,2*,杨兆祥1,李翠娥2，高宏涛1

(1.昆明制药集团股份有限公司，云南 昆明 650100； 2.昆明医科大学，云南 昆明 650500)

目的：建立百宝丹喷雾剂的微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2010版要求 ，采用常规法和培养基稀释法对具有代表性的细菌、霉菌、酵母菌进行回收率测定,并对控制菌检查法进行方法学验证。结果：采用培养基稀释法(0.2mL/皿)，5种试验菌的回收率均大于70%；采用培养基稀释法(供试液10mL+增菌培养基800mL)检查金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，试验组和阳性对照组呈阳性反应，阴性菌对照组呈阴性反应。结论：可采用培养基稀释法对百宝丹喷雾剂进行微生物限度检查。

百宝丹喷雾剂；微生物限度检查；方法学验证

百宝丹喷雾剂是以曲焕章先生创制的百宝丹散剂为基础，结合现代制剂手段和技术研制而成的新型外用制剂，具有良好的镇痛抗炎作用[1]。《中国药典》2010版规定，口服、外用药品的微生物限度检查，应进行细菌 、霉菌及酵母菌计数方法的验证 ，以确认所用的方法适合该产品的检测。而对具有抑菌作用的产品，由于在试验条件下存在对待检菌的干扰，必须采取适当的方法消除或减弱供试品的抑菌活性，从而顺利检出供试品所污染的各种微生物。本文旨在按照中国药典的要求 ，建立百宝丹喷雾剂的微生物限度检查方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HTY-2000A集菌仪(杭州高得医疗器械有限公司)；开放式集菌器(北京牛牛基因技术有限公司)；303-6B隔水式恒温培养箱(南通科学仪器厂)；霉菌培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)。

1.2 供试样品

百宝丹喷雾剂(批号：20140804、20140805、20140806，昆明制药集团股份有限公司药物研究院)。

1.3 培养基

营养琼脂培养基(批号：111222)、改良马丁液体培养基(批号：120410)、营养肉汤培养基(批号：120416)、改良马丁琼脂培养基(批号：120319)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号：120207)、胆盐乳糖培养基(批号：120322)均由北京三药科技开发公司提供。甘露醇高盐琼脂培养基(批号：20130918)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号：20140305)均由青岛日水生物科技有限公司提供。

1.4 菌种

白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger) [CMCC(F)98003]、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]、大肠埃希菌(Escherichiacoli) [CMCC(F)44102]均由中国食品药品检定研究院提供。

2 实验方法

2.1 菌液制备

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于24～26℃培养48h，用0.9%的无菌氯化钠溶液稀释，制成1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。

接种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于32～35℃培养24h，用0.9%的无菌氯化钠溶液稀释，制成1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。

接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，于24～26℃培养5d，用5mL 0.9%的无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，洗脱液用5mL 0.9%的无菌氯化钠溶液稀释，制成1mL含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。

2.2 供试液制备

取供试样品10mL，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，混匀，制成1∶10供试液备用。

2.3 菌落计数方法及验证

2.3.1 菌落计数方法 采用常规法(1mL/皿)和培养基稀释法(0.2mL/皿)对细菌、霉菌及酵母菌进行菌落计数，通过回收率测定进行方法学验证[2]。

2.3.2 回收率测定 试验组：取1∶10供试液1mL、含50～100cfu试验菌的菌液1mL加入平皿中，5种试验菌每种菌平行制备2个平皿。在加有枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌液的平皿中，立即倾注营养琼脂培养基20mL，待凝固后，于30～35℃培养72h，观察记录菌落数；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基20mL，待凝固后，于23～28℃培养120h，观察记录菌落数。菌液组：取含50～100cfu试验菌的菌液1mL加入平皿中，5种试验菌每种菌平行制备2个平皿。其余操作同试验组。供试品对照组：取1∶10供试液1mL加入平皿中，共制备4个平皿。在2个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基20mL，待凝固后，于30～35℃培养72h，观察记录菌落数；在另外2个平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基20mL，待凝固后，于23～28℃培养120h，观察记录菌落数。回收率计算方法：试验组的菌回收率(%)=(试验组菌落数平均值-供试品对照组菌落数平均值)/菌液组菌落数平均值×100%。

2.3.3 培养基稀释法回收率测定 试验组：取1∶10供试液0.2mL、含50～100cfu试验菌的菌液1 mL加入平皿中。其余操作同常规法。菌液组：同常规法。供试品对照组：取1∶10供试液0.2mL加入平皿中，共制备4个平皿。其余操作同常规法。回收率计算方法同常规法。

2.4 控制菌检查方法及验证

2.4.1 金黄色葡萄球菌检查方法及验证 试验组：取供试液10mL、含50～100cfu金黄色葡萄球菌的菌液1mL各3份，分别加入100、500、800mL营养肉汤培养基中，于30～35℃培养24h。

阳性对照组：取含50～100cfu金黄色葡萄球菌的菌液1mL各3份，分别加入100、500、800mL营养肉汤培养基中，于30～35℃培养24h。

阴性菌对照组：取供试液10mL、含50～100cfu大肠埃希菌的菌液1mL各3份，分别加入100、500、800mL营养肉汤培养基中，于30～35℃培养24h。

供试品组：取供试液10mL各3份，分别加入100、500、800mL营养肉汤培养基中，于30～35℃培养24h。

金黄色葡萄球菌检查方法：取上述营养肉汤培养液1mL，划线接种在甘露醇高盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养24h后观察结果。

2.4.2 铜绿假单胞菌检查方法及验证 试验组：取供试液10mL、含50～100cfu铜绿假单胞菌的菌液1mL各3份，分别加入100、500 、800mL胆盐乳糖培养基中，于30～35℃培养24h。

阳性对照组：取含50～100 cfu铜绿假单胞菌的菌液1mL各3份，分别加入100mL、500mL 、800mL胆盐乳糖培养基中，于30～35℃培养24 h。

阴性菌对照组：取供试液10mL、含50～100 cfu金黄色葡萄球菌的菌液1mL各3份，分别加入100、500、800mL胆盐乳糖培养基中，于30～35℃培养24h。

供试品组：取供试液10mL各3份，分别加入100、500、800mL胆盐乳糖培养基中，于30～35℃培养24h。

铜绿假单胞菌检查方法：取上述胆盐乳糖培养物1mL，划线接种在溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养24h后观察结果。

3 实验结果

3.1 菌落计数方法

由表1可见，百宝丹喷雾剂对枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉菌均有较强作用，常规法(1mL/皿)不适用上述5种菌株的菌落计数；采用培养基稀释法(0.2mL/皿)，能有效消除或减弱百宝丹喷雾剂的抑菌活性，使5种试验菌的回收率均达到70%以上。

3.2 控制菌检查方法

从表2可以看出， 采用供试液10mL+增菌培养基100 mL的常规法以及供试液10mL+增菌培养基500mL的培养基稀释法，均不能有效检出试验组中的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌；而供试液10mL+增菌培养基800mL的培养基稀释法能同时检出试验组和阳性对照组中的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，适用于百宝丹喷雾剂控制菌的检查。

4 讨论

百宝丹喷雾剂系采用三七、滇草乌、金铁锁和重楼的乙醇提取物外加增溶剂、乳化剂、渗透剂等制成的新型外用制剂，这些药物和助剂成分对微生物具有一定的抑制作用，如已有研究表明，重楼对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等细菌和真菌具有较强的抑制作用[3-4]。由于这些成分的存在，对百宝丹喷雾剂中污染的微生物造成不同程度的抑制，但当生存环境如抑菌浓度等发生变化时，这些微生物便可复苏繁殖，造成产品质量问题，危害人体健康。因此，在对百宝丹喷雾剂进行微生物检查时，必须采取适当的方法消除或减弱其抑菌活性，建立一种适合该产品的微生物检查方法。

本研究表明，采用培养基稀释法(0.2mL/皿)能有效消除百宝丹喷雾剂对枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉菌的抑菌活性，使5种试验菌的回收率均达到70%以上；供试液10mL+增菌培养基800mL的培养基稀释法能同时检出试验组和阳性对照组中的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，适合于百宝丹喷雾剂控制菌的检查。

表1 回收率测定结果 (%)

表2 控制菌检查方法的验证

[1] 周荣光,杨兆祥,赵加强,等. 百宝丹喷雾剂的抗炎镇痛作用和急性毒性研究[J].中成药，2013,35(5):911-914.

[2] 国家药典委员会．中华人民共和国药典(二部)[S]．北京：中国医药科技出版社，2010：107-116.

[3] 王强，徐国钧，程永宝，等. 中药七叶一枝花类的抑菌和止血作用研究[J].中国药科大学学报，1989,20(4)：251-253.

[4] 欧阳录明，黄晓敏，吴兴无，等. 中草药体外抗白色念珠菌的实验研究[J].中国中医药信息杂志，2000,7(3)：26-27.

(责任编辑：余 婷)

Validation of Microbial Limit Tests of Baibaodan Spray

Zhao Jiaqiang1,Zhou Rongguang1,2*,Yang Zhaoxiang1,Li Cuie2，Gao Hongtao1

(1.Institute for Drug Research and Development of Kunming Pharmaceutical Corporation, Kunming 650100, China;2.School of Pharmaceutial Science, Kunming Medical University, Kunming 650500, China)

Objective:To establish a microbial limits testing methods for Baibaodan spray.Methods:Referring to Chinese Pharmacopoeia (2010 edition ) ，the validation of counting method of bacteria，mold and yeast，and the validation of control bacteria check method was done in accordance with the conventional method and the medium dilution method. Results:Using the culture medium dilution method(0.2mL/dish) ，the recovery rates of 5 test microorganisms were all more than 70%.StaphylococcusaureusandPseudomonasaeruginosacan be detected by the medium dilution method(testing solution 10mL plus culture medium 800mL). Conclusion:The medium dilution method could be used for microbial llimit tests of Baibaodan spray.

Baibaodan Spray；Microbial Limit Test;Methodology Validatio

2015-06-15

云南省科技计划项目(2013FZ260)

赵加强，男，昆明制药集团股份有限公司工程师，研究方向为药物质量。

周荣光,男，昆明制药集团股份有限公司高级工程师，昆明医科大学硕士生导师，研究方向为药物制剂。E-mail:rgzhousy@163.com

R284.1

A

1673-2197(2015)21-0023-03

10.11954/ytctyy.201521010