正交试验优选枸杞黄酮提取工艺

彭小敏，梁秋平，刘劭勉，余文新，邓广海

(广东省中医院 药学部，广东 广州 510120)



正交试验优选枸杞黄酮提取工艺

彭小敏，梁秋平，刘劭勉，余文新，邓广海*

(广东省中医院 药学部，广东 广州 510120)

目的：优选枸杞的最佳提取工艺，为其制剂的制备提供一定参考依据。方法：以总黄酮和芦丁的测得量为评价指标，采用正交试验法考察乙醇百分数、料液比、提取时间和提取温度4个影响因素，优选枸杞的超声提取工艺。结果：枸杞黄酮最佳提取工艺为A3B2C3D3，即乙醇体积分数80%，料液比1︰30，提取时间为30min，提取温度80℃。结论：该工艺简单可行，成本低廉，安全可靠，可用于枸杞制剂工业化生产。

枸杞；总黄酮；芦丁；超声提取法；正交设计

枸杞为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实[1]，主要分布于宁夏、新疆、内蒙古、青海等地，是我国名贵药材。宁夏枸杞的化学成分主要为色素类、黄酮类和多糖类，另外含有甜菜碱、维生素C、莨菪亭、多种氨基酸及多种微量元素[3]。研究表明，黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、清除自由基等作用[4-6]，是枸杞的主要有效成分之一。如何科学有效提取枸杞中有效成分一直以来都是中药制剂研究的热点，目前，有学者采用热浸法、微波提取对枸杞中多糖、总黄酮、芦丁等成分进行提取[7-10]。超声提取法具有实验设备简单，操作方便，提取时间短，产率高，无需加热等优点，在工业生产中具有广阔的应用前景。文献研究表明，以总黄酮和芦丁含量为评价指标，综合考察枸杞超声提取工艺研究未见报道。本文采用正交试验优选枸杞黄酮的超声提取工艺，为其制剂的制备提供一定参考依据。

1 仪器与材料

Agilent-1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、UV2401-PC紫外分光光度计(日本岛津)、KQ-300VDB型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；芦丁(批号：100080-201011)对照品均购于中国药品生物制品检定所，枸杞(批号：150124751)药材由康美药业股份有限公司提供，经广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定为枸杞为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L. 的干燥成熟果实；甲醇为分析纯，乙醇、正丁醇等试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 提取工艺设计

实验采用超声提取法考察枸杞中黄酮类成分提取工艺，根据预实验结果，超声处理的功率和频率分别选择250W，40kHz。对枸杞黄酮类成分溶出度主要影响因素进行考察(乙醇百分数、料液比、提取时间、提取温度)，每个因素选择3个水平(见表1)。实验采用综合加权评分法，以总黄酮和芦丁的含量作为评价指标，各指标进行“隶属度”的计算，其指标隶属度=(测定值-最小测定值)/(最大测定值-最小测定值)，0≤指标隶属度≤1。其具体的权重为：总黄酮得率占50%，芦丁得率占50%。综合评分=总黄酮得率隶属度×50%+芦丁得率隶属度×50%，满分为1.00分。

实验称取枸杞干燥样品(过3号筛)2.0 g，加入到100 mL具塞的锥形瓶中，按照L9(34)正交表的试验顺序进行操作，滤过，并用少量80%乙醇洗涤药渣，洗液并入滤液于100 mL容量瓶中，用80%乙醇定容，摇匀，即得。

表1 影响因素和水平

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液制备 精确称取120℃干燥至恒重的芦丁标准品25.2mg，用70%乙醇水浴微热溶解，并完全转入50mL容量瓶中，用70%乙醇定容，得0.504mg/mL的芦丁对照溶液。

2.2.2 标准曲线测定 精确吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL芦丁对照溶液，分别置于10mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0mL，摇匀后放置8min，继续加10%A1(NO3)3溶液1.0mL，摇匀，放置6min，加1.5 mol/L NaOH溶液5.0mL和60%乙醇至刻度，摇匀，放置10min，然后取3mL于510nm处测定吸收值，绘制标准曲线，得标准曲线方程为：A=12.131C-0.001 4(r=0.999 5)，说明对照品溶液在0.020 4～0.100 8mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 精密度考察 精密移取芦丁对照品1.0mL，平行操作5次，按照“2.2.2”项下步骤操作，测定其吸光度A，计算RSD(n=5)值,结果其RSD=0.19%。

2.2.4 含量测定 精确吸取供试品溶液1.0mL，按照“2.2.2”项步骤操作，测定枸杞中总黄酮的含量。

2.3 芦丁含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Extend C18(250mm×4.6mm,5μm) ；流动相：甲醇-0.5%磷酸水溶液(40︰60)；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：255nm；进样量为5μL。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品适量，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得0.132mg/mL芦丁的对照品混合溶液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.3.3 供试品溶液处理 精密供试品溶液50mL，40℃减压浓缩，浓缩液经HPD-600型大孔树脂，蒸馏水洗脱除去水溶性杂质后，再用50%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液50mL为供试品溶液，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.3.4 标准曲线制备 精密吸取对照品溶液1mL置于2、5、10、20、25mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，按照上述色谱条件，测定芦丁的峰面积，以峰面积Y为纵坐标，进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程为：Y=4 752.3X+16.324(R2=0.999 6)；线性范围为：0.005 28～0.13200mg/mL。

2.3.5 含量测定 按照上述“2.3”项下的含量测定方法，测定枸杞不同提取液样品中芦丁的含量。结果见表2、图1。

表2 枸杞超声提取工艺正交设计实验结果

表3 方差分析结果

注：F0.01(2,2)=99,F0.05(2,2)=19。

极差R结果表明，影响枸杞中黄酮提取工艺程度依次为：D(提取温度)>A(乙醇百分数)>B(料液比)>C(提取时间)，方差分析结果表明，A、D(P<0.05)两个因素对枸杞提取工艺有明显的影响，因素B、C均没有明显的差异，为了节省溶剂，经综合考虑，得出最佳的提取工艺为：A3B2C3D3，即乙醇体积分数80%，料液比1︰30，提取时间为30min，提取温度80℃。

3 讨论

枸杞具有滋补肝肾、益精明目的作用，为临床广泛使用的补益药。研究表明，黄酮类成分是枸杞的主要有效成分，如何利用现代技术，简单快捷、高效地提取其有效成分是目前研究的热点，也是其制剂生产迫切需要解决的问题。枸杞黄酮提取方法较多，实验比较了微波提取法、回流提取法和超声提取法，结果表明超声提取法所得到的总黄酮提取率较大，为进一步优化枸杞黄酮的超声提取工艺，实验对其主要影响因素进行了考察，最终优选出枸杞的最佳提取工艺，该工艺操作简单、省时、成本低廉，稳定性好，应用于工业化生产将产生一定的经济效益，为该药材综合利用开发提供理论依据。

图1 枸杞黄酮提取液含量测定HPLC色谱

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:232.

[2] 张磊,郑国崎,膝迎凤,等.不同产地宁夏拘把果实品质比较研究[J].西北药学杂志,2012,2(73)：195-198.

[3] 黄燕萍.枸杞的研究进展[J].中国基层医药,2010,17(1)：125-127.

[4] 刘成梅,游海.天然产物有效成分的分离与应用[M].北京:化学工业出版社,2003:1.

[5] 黄元庆,谭安民,沈泳,等.枸杞黄酮类化合物清除氧自由基及对小鼠L1210癌细胞能量代谢的抑制作用[J].卫生研究,1998,27(2):109.

[6] 黄元庆,鲁建华,沈泳,等.枸杞总黄酮类化合物抗脂质过氧化研究[J].卫生研究,1999,28(2):115.

[7] 刘军海,任惠兰,李风风,等.响应面分析法优化枸杞多糖提取工艺条件[J].时珍国医国药,2008,19(4):935-937.

[8] 韩荣生,李鹏.枸杞中总黄酮提取工艺的研究[J].国医论坛,2011,26(2):39-42.

[9] 张义军,陈丽.均匀设计法优选枸杞提取工艺[J].时珍国医国药,2008,19(10): 2457-2458.

[10] 罗永,曾雪花.枸杞子不同浓度乙醇提取物中总黄酮含量比较研究[J].安徽医学,2011,32(5)：646-647.

(责任编辑：余 婷)

Ultrasonic-assisted Extraction of flavonoids from Lycium barbarum L

Peng Xiaoming,Liang Qiuping,Liu Shaomian,Yu Wenxin，Deng Guanghai*

(Department of Pharmacy,Guangdong Provincial Hospital of TCM,Guangzhou 510120,China)

Objective:To select the ultrasonic-assisted extraction conditions from Lycium barbarum L. and provide a reference for the preparation of the formulation. Methods:With the extraction rate of total flavonoids and rutoside as the investigation index,to study four factors of ethanol percentage,solid-liquid ratio,extraction time and extraction temperature by orthogonal design,and the best extraction conditions was optimized. Results:The best ultrasonic extraction conditions were 80% ethanol percentage,solid-liquid ratio was 1∶30,extraction time was 30 min,extraction temperature was 80 °C. Conclusion:The process was simple and feasible,low-cost,safe and reliable,and could be used for industrial production of sarsaparilla preparations.

Lycium Barbarum L.;Total Flavonoids;Rutoside;Ultrasonic Extraction;Orthogonal Design

2015-04-18

彭小敏，女，广东省中医院中药师，研究方向为医院药学。

邓广海(1983-)，男，硕士，广东省中医院主管中医师，研究方向为中药剂量鉴定。

R284

A

1673-2197(2015)17-0024-03

10.11954/ytctyy.201517012