考马斯亮蓝法测定天花粉饮片水煎剂中蛋白质含量

张继州，韩 静，张 宽，贺肇东，庞文生，胡 娟，3*

(1.福建省中医药研究院，福建 福州 350003；2.福建中医药大学附属福建省第二人民医院，福建 福州 350003；3.福建中医药大学 药学院，福建 福州 350122)



考马斯亮蓝法测定天花粉饮片水煎剂中蛋白质含量

张继州1，韩 静1，张 宽2，贺肇东1，庞文生2，胡 娟1，3*

(1.福建省中医药研究院，福建 福州 350003；2.福建中医药大学附属福建省第二人民医院，福建 福州 350003；3.福建中医药大学 药学院，福建 福州 350122)

目的：测定治疗脑卒中及其后遗症的经典方栝楼桂枝汤中的君药天花粉饮片水煎剂中蛋白质的含量。方法：采用考马斯亮蓝法，利用考马斯亮蓝染料与蛋白质中的碱性基团相结合的原理，通过分光光度计测量待测溶液吸光度，得出其蛋白浓度。结果：浓度分别为0.5g/mL和1.0g/mL的天花粉饮片水煎剂，其蛋白质含量分别为106.6μg/mL和132.6μg/mL。结论：该测定方法快捷、方便、灵敏度高，为后续研究奠定了基础。

天花粉；栝楼桂枝汤；考马斯亮蓝法；蛋白质；含量测定

天花粉是葫芦科植物栝楼根的切片。《本草纲目》称：“栝楼根，味甘微苦酸，酸能生津，故能止渴润枯，微苦降火，甘不伤胃。”天花粉蛋白(Tichosanthin，TCS)是从天花粉中提取的一组单链核糖体失活蛋白，具有抗孕引产、抑制肿瘤、抗病毒、免疫抑制等生理活性[1]。而天花粉作为治疗脑卒中及其后遗症的经典方栝楼桂枝汤中的君药，对于药效有着关键性的影响[2-3]。考马斯亮蓝(Coomassie BriLLiant BLue)法又称Bradford法，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合，使染料最大吸收峰的位置由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595nm处光吸收的增加量，可以得到与考马斯亮蓝结合的蛋白质的量。该测定法具有超过其他几种方法的优点，是目前灵敏度最高的蛋白质测定法，因而得到广泛的应用[4]。本实验采用考马斯亮蓝法测定天花粉饮片水煎剂中的蛋白质含量，为探究其药理活性及临床应用提供重要依据。

1 仪器与材料

牛血清白蛋白(北京索莱宝科技有限公司)、考马斯亮蓝G250、95%乙醇、磷酸均为国药集团化学试剂有限公司分析纯、天花粉饮片(福建中医药大学国医堂提供)、去离子水。722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)。

2 试验方法

2.1 溶液制备

2.1.1 考马斯亮蓝溶液配制 取考马斯亮蓝G-250 20mg溶于10mL 95%乙醇，混匀，加入20mL 85%磷酸，最后用去离子水定容至200mL。

2.1.2 标准蛋白质溶液配制 取2mg牛血清蛋白于去离子水中配成含蛋白质2mg/mL母液。用去离子水梯度稀释标准蛋白质溶液，浓度分别为40、80、120、160、200μg/mL。

2.1.3 天花粉水煎剂制备 称取药材15、30g，分别加去离子水300mL，煎煮、浓缩成少于30mL的液体，用去离子水将浓缩液定容至30mL，获得水煎剂中的生药浓度为0.5g/mL、1.0g/mL。

2.2 含量测定

2.2.1 蛋白标准曲线制定 取上述配制的蛋白质溶液各600μL于干净试管内，并标明各管浓度，每管加入考马斯亮蓝溶液3mL，混匀。以去离子水作为空白对照，用去离子水对紫外分光光度计进行校正，标准空白管调零。按蛋白质标准液浓度由低到高进行测定，每个浓度测定3次，取平均值，以蛋白质浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。

2.2.2 天花粉饮片水煎剂蛋白质含量测定 取“2.1.3”中制得的水煎液，过滤，各取600μL于干净试管内，加入考马斯亮蓝溶液3mL，混匀。用标准空白管进行调零。不同样品浓度各测定3次，取平均值，根据样品吸光度值，由“2.2.1”所得标准曲线计算出待测水煎剂蛋白浓度。

3 结果

3.1 蛋白标准曲线制定

依照“2.2.1”方法，测定浓度依次为40、80、120、160、200μg/mL标准蛋白溶液的OD值(表1)；绘制蛋白标准曲线，见图1。其线性回归方程式为：Y=0.004X+0.0886，R2=0.998 5。

表1 标准蛋白吸光度测定值

图1 蛋白标准曲线

3.2 天花粉饮片水煎剂蛋白质含量测定结果

将浓度分别为0.5g/mL和1.0g/mL的天花粉饮片水

煎剂测得的吸光度OD值代入标准曲线，计算出天花粉饮片水煎剂样品中蛋白质的含量，结果见表2。

表2 天花粉水煎剂蛋白质含量

4 讨论

本研究结果所示，1.0g/mL浓度的天花粉饮片水煎剂中蛋白质的浓度为0.5g/mL浓度的1.24倍，达不到2倍的理论值，故可能存在影响水煎剂蛋白含量的因素，如蛋白质发生聚集或三级结构在水煎过程中发生改变等,有待进一步探究。

[1] 王飞 ,丁玉,陈明达,等.天花粉蛋白的纯化技术进展及其药理概况[J].安徽农业科学，2010,38(1):29-30,41.

[2] 陈瑛玲,陈立典，陶静.栝楼桂枝汤治疗中风后肢体痉挛的临床研究[J].中医临床研究，2013,5(4):7-9.

[3] 黄庆勇，李煌，许文，等.君药天花粉对复方栝楼桂枝汤中9种成分的影响[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(12):57-60.

[4] 王孝平,邢树礼.考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J].天津化工,2009,23(3)：40-41．

(责任编辑：魏 晓)

2015-04-13

福建省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1035-14)；福建省科技计划重点项目(2013Y0047)；福建省教育厅项目(JB13090)；福建中医药大学校管科研课题(XB2013037)

张继州(1989-)，男，福建省中医药研究院研究实习员，研究方向为中药药理。

胡娟(1962-)，女，福建中医药大学教授，研究方向为中药药效物质基础。E-mail：huj@fjtcm.edu.cn

R284.2

A

1673-2197(2015)17-0020-01

10.11954/ytctyy.201517010