高效液相色谱-二极管阵列检测器测定邻苯二甲酸酯色谱条件优化

沈小明，时 磊，吕爱娟，沈加林，胡璟珂，蔡小虎，代静玉

1．南京地质矿产研究所，江苏 南京 210016

2．南京农业大学资源与环境科学学院，江苏 南京 210095

邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters，PAEs)又称酞酸酯，作为一种主要的增塑剂被广泛地应用于塑料生产工业中。已有资料表明，全球PAEs的年产量可达500万 t，中国每年用于PVC加工制造的增塑剂已经超过100万 t，其中PAEs用量可占到90%左右［1-2］。由于PAEs与塑料产品的基质之间不以化学键相结合并且彼此化学性质相对独立，在使用过程中PAEs会从塑料制品中不断迁移、浸出并释放到空气、水体、土壤和沉积物等环境介质中。PAEs是一类典型的环境内分泌干扰物，有明显的“三致”作用和生殖毒性［3-4］。美国环境保护署(EPA)将6种PAEs物质，邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DnOP)列入优先控制有毒污染物名录，中国也将 DMP、DEP、DnOP 3种化合物确定为优先控制的环境有机污染物［5］。

诸多研究报道了带氢火焰检测器(FID)或电子捕获检测器(ECD)的气相色谱法(GC)［6-7］、气相色谱-质谱法(GC-MS)［8］、带紫外检测器(UV)或二极管阵列检测器(DAD)的高效液相色谱法(HPLC)［9］、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)［10-11］等不同种类仪器用于PAEs的分析测定。由于PAEs类物质具有较高的沸点，应用GC或GC-MS测定时对气化温度、柱温具有较高要求，相比较而言，HPLC适用范围更为广泛，可用于大多数有机化合物的分析。二极管阵列检测器与普通的紫外检测器相比，可做随峰扫描，同时可获得三维色谱-光谱图，并根据色谱的保留时间、光谱信息提高定性的可信度［12］。因此，本文建立并研究了应用HPLC-DAD测定6种EPA优先控制PAEs过程中的各种影响因素，优化了相关色谱条件，从而为快速、准确地测试实际样品提供分析依据和技术参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国):配二极管阵列检测器。

分析天平(0.1 mg感量，AL104，美国)，气密性进样针(100 μL、1 mL，瑞士)，WH-3 漩涡振荡仪(中国)，Milli-Q A10纯水仪(美国)。

A级容量瓶:(50±0.06)mL、(10±0.04)mL，棕色。

6种邻苯二甲酸酯标准物质单标(德国Dr．Ehrenstorfer公司)。分别为DMP单标(0.5 g，纯度 99.5%)，DEP 单标(0.5 g，纯度 99.5%)，BBP单标(0.25 g，纯度 99.5%)，DBP 单标(0.5 g，纯度99.0%)，DEHP 单标(0.5 g，纯度 99.0%)，DnOP 单标(0.25 g，纯度99.0%)。

甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，超纯水(18 MΩ·cm)。

1.2 标准溶液的配制

在25℃室温环境下，将装有一定量甲醇溶剂的50 mL棕色容量瓶置于分析天平上，去皮后，用气密性进样针移入适量的PAEs单标，准确记录读数，再用甲醇定容至刻度，于漩涡振荡仪上振荡均匀，得到各单标储备溶液(DMP、DEP、BBP、DBP、DEHP、DnOP)的浓度分别为 9 000、9 000、4 000、9 000、9 000、4 000 mg/L。分别移取上述6种单标储备溶液各1 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度为900 mg/L的DMP、DEP、DBP、DEHP 和浓度为 400 mg/L 的BBP、DnOP混和标准储备溶液。

上述标准储备溶液于4℃冷藏柜中避光保存。实际测定时，先将PAEs混合标准储备溶液取出平衡至25℃，再将其稀释为4.5～180、2～80 mg/L浓度梯度的标准溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱:SupelcosilTMLC色谱柱(15 cm×4.6 mm，0.5 μm)。流动相:乙腈和水，根据条件实验设定梯度洗脱比例分别为 100∶0、80∶20、60∶40、50∶50，设定流速分别为 0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min，柱温25 ℃，进样量 15 μL。

DAD检测器扫描波长范围为190～400 nm，带宽2 nm。

2 结果与讨论

2.1 不同梯度洗脱和流速下PAEs的色谱响应

每一实验条件下获得的PAEs混合标准谱图均与同一条件下各单标的谱图对比，以保留时间来确保定性的准确性。流速恒定条件下，当流动相为纯乙腈时，仅DEHP、DnOP两种物质能够达到基线分离，为了减少分析时间，后续梯度实验均将DEHP、DnOP两种物质出峰时的流动相调节为100%乙腈。流动相比例的变化，改变了色谱梯度洗脱的强度，进而影响了标准物质的分离效果，但不会对6种PAEs的出峰顺序产生影响。随着流动相中水的比例越来越大，其余4种PAEs也逐渐分离开来。当流动相乙腈-水的体积比为50∶50时，6种PAEs物质均能达到基线分离，其出峰顺序依次为 DMP、DEP、BBP、DBP、DEHP、DnOP，且各色谱峰峰形对称、尖锐，满足后续定量分析的要求。因此，实验设定 DMP、DEP、BBP、DBP出峰时流动相乙腈-水梯度比例为 50∶50，DEHP、DnOP 出峰时流动相调整为100%乙腈。

在流动相比例确定的条件下，考察了不同流速条件对PAEs各标准物质色谱响应的影响，见表1。

表1 不同流速下6种PAEs的色谱响应

结果表明，流速对PAEs各物质的出峰时间、峰高和峰面积均有较大的影响。随着流速的增加，标准物质出峰的保留时间均随之缩短，DMP保留时间由4.84 min变为2.43 min，减少近一半。最后出峰的DnOP保留时间由16.49 min减少为12.49 min。可见流速增加的情况下，目标物质出峰时间大大提前，可以为大批量实际样品的分析和测定节约时间。

但在流速增大的同时，标准物质的色谱响应也在减弱，流速分别为0.8、1.0、1.2 mL/min情况下的PAEs各物质的峰面积分别仅占流速0.6 mL/min的74.6% ～75.0%、56.0% ～60.7%、48.9%～49.7%。这是因为二极管阵列检测器作为一种浓度型检测器，当进样量一定时，各目标化合物的峰面积与流速成反比关系，且峰面积与流速的乘积为一常数。各物质峰高分别占流速0.6 mL/min的78.6% ～92.7%、67.0% ～88.1%、58.5% ～82.4%。

由于实际环境样品中PAEs大多处于痕量污染水平，综合考虑样品测试效率、分析精度及实际样品中存在杂质干扰等因素，选择响应较高，同时出峰时间较短的流速0.8 mL/min作为最终色谱分析的流速条件。在流速确定的前提下，梯度洗脱的最终条件设定为洗脱0～11 min，流动相乙腈-水梯度比例为50∶50，11 min后流动相调整为100%乙腈。

2.2 波长的选定及对PAEs测定的影响

二极管阵列检测器可以记录目标化合物在一定波长范围内的吸光度，同时获得不同波长下的光谱图。利用DAD检测器对6种PAEs标准物质进行波长(190～400 nm)扫描，其特征吸收波长见图1。

图1 PAEs的特征波长

从图1可以看出，6种PAEs物质的紫外吸收谱图差别不大，每种化合物均有3个特征吸收波长，分别为 200、225、275 nm。在波长为 200 nm时，吸收强度最大，但是该波长处干扰杂质较多且作为流动相的乙腈也存在紫外吸收，进而影响了目标化合物的测定。

在上述确定的流动相比例及流速条件下，分别对225、275 nm两个波长下同一浓度的PAEs标准物质谱图进行比较，见图2。

图2 不同波长下PAEs标准物质色谱图

从图2可以看出，两个波长下PAEs标准物质的色谱响应存在明显差异，225 nm波长下的色谱峰均大于275 nm。因此，研究确定PAEs的测定波长为225 nm。

2.3 标准曲线

根据“1.2节”的描述配制标准系列溶液，在优化的色谱条件下采用外标法定量。以各PAEs化合物的浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标绘制校准曲线，所得标准曲线的回归方程和相关系数见表2。表2结果表明，在所设定的浓度范围内，6种PAEs的线性良好，相关系数均大于0.999 80，完全满足实际样品的定量分析要求。

表2 PAEs校准曲线回归方程和相关系数

2.4 仪器检出限和方法精密度

图3 PAEs仪器检出限示意图

仪器检出限是仪器在一定置信度内目标化合物检测信号与噪声信号有明显差异时所对应的量，是反映仪器灵敏度的一项重要指标［13］。一般在仪器运行稳定的前提下，对配制好的已知浓度标准物质进行检测，将所得化合物的峰高(S)与噪声峰高(N)进行比较，当S/N大于3时，对标准物质进行准确稀释，直到S/N等于或略小于3，此时的浓度即为该化合物的仪器检出限。PAEs的仪器检出限见图3。

Agilent 1100液相色谱工作站数据分析模块中，在选定仪器噪声时间段的前提下，会自动计算目标化合物的仪器检出限。根据上述的测定流程，6种PAEs的仪器检出限结果见表3。

从表3中可知，6种PAEs物质的仪器检出限范围为0.08～0.12 mg/L，考虑到实际进样体积为15 μL，则6 种PAE 的最小检测量［10］(MDA)范围为1.2～1.8 ng。本方法仪器检出限低于钟嶷盛等［14］用GC-FID测定公园水体中邻苯二甲酸酯的检出限0.40～4.58 mg/L，与张小辉等［15］报道的GC-MS法测定土壤中PAEs检出限较为接近(MDA 为 1.005 ng)，高于李红等［16］用 GC-MS/MS测定土壤中PAEs的检出限(MDA为1～5 pg)。本方法灵敏度较高，适合土壤等邻苯二甲酸酯含量较高的基质样品的快速分析测定。

表3 6种PAEs的仪器检出限

在优化的色谱条件下，对同一浓度PAEs混合标准进行6次连续测定，计算每种目标化合物保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)，见表4。保留时间的RSD范围为0.02% ～0.06%，峰面积的RSD范围为0.13% ～0.86%，该方法对6种PAEs的测定具有良好的精密度。

表4HPLC-DAD测定PAEs方法精密度

3 实际土壤样品分析

称取5.0 g土壤样品于具塞三角玻璃瓶中，加入40 ml正己烷-二氯甲烷混合溶剂(两者所占比例均为50%)，浸泡过夜。于25℃水浴中超声20 min，重复2次，合并提取液，旋转蒸发至小体积，转移至SPE硅胶柱净化，用10 ml丙酮-正己烷混合溶剂(其中丙酮所占比例为10%，正乙烷所占比例为90%)洗脱，收集洗脱液，氮吹浓缩，乙腈定容至1 ml。

利用最终优化的HPLC-DAD色谱条件对实际土壤样品提取液进行测定，实际土壤样品中6种PAFs分析结果见表5。

表5 实际土壤样品中6种PAEs分析结果 μg/g

从表5中可以看出，土壤中DMP、DEP、DEHP普遍检出，其含量分别为0.43～1.68、0.21～0.96、0.11 ～3.12 μg/g。该方法对实际土壤样品中优控PAEs的分析具有较好的适应性。

4 结论

在优化梯度洗脱、流速、检测波长等色谱条件参数的基础上，建立了HPLC-DAD测定6种邻苯二甲酸酯的分析方法。邻苯二甲酸酯DAD检测最佳波长为225 nm，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，各化合物均能完全分离，优化后的流速为0.8 mL/min。利用该方法对实际土壤样品的分析测定也取得了比较满意的结果。该方法操作简便、分析时间短，具有较好的精密度及较高的灵敏度，适用于批量样品的快速分析测定，对于较高沸点疏水性有机化合物的HPLC-DAD测定方法的优化和确立有一定借鉴意义。

由于该方法仅针对6种优控邻苯二甲酸酯进行测定，其他PAEs化合物是否适合仍需论证。此外，应进一步加强对基体复杂、干扰物更多的生物等环境样品中PAEs分离和测定研究。

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