“秋水仙素诱发蚕豆多倍体实验”中诱发因素最佳组合的探索

赵锦慧

高等植物染色体进化有一个显著的特征即染色体会加倍,植物染色体加倍后可以使植物的生态适应力和对逆境的抗性增强.主要表现为对环境的适应性增强,抗寒、抗旱及抗病虫害的能力增强[1-3].目前,秋水仙素是使用最多、应用最广泛的化学诱导剂.在一定的浓度范围内,秋水仙素对培养材料没有特殊要求,能明显提高新生细胞的染色体加倍诱导率,经秋水仙素处理后的细胞在正常条件下又可以恢复正常分裂.诱导多倍体时,为了保证有较高的成功率,往往对秋水仙素的处理浓度和处理时间组合要求比较高[4].因此,实验室急需解决的问题就是针对某种植物,选出最适合的诱导方法进行多倍体植株的诱导,并因此获得稳定生长的多倍体植株[5].

本实验以蚕豆胚根膨大率和胚根诱导率为指标,再通过染色体的倍性变化、保卫细胞大小的变化及气孔大小对多倍体诱导结果进行鉴定.同时,对诱导出的蚕豆多倍体植株的胚根和幼苗的生长状况进行调查分析,旨在筛选秋水仙素诱导蚕豆多倍体的最佳处理浓度和处理时间组合,为秋水仙素诱导蚕豆多倍体提供最佳的实验方案.

1 材料与方法

1.1 材料

蚕豆种子,购于周口市种子公司.

1.2 方法

1.2.1 种子处理、胚根培养及秋水仙素处理[6]

将蚕豆种子洗净,用5%次氯酸钠消毒1 h,在室温(25℃)下浸种24 h后光照培养.胚根长至1.5 cm左右时,选取长势一致的种子分成6组,分别用0.000%,0.025%,0.050%,0.100%,0.150%,0.200%的秋水仙素溶液浸泡.每组又分成4份,各份处理时间分别是12,24,48,60 h,“浓度×时间”共24个处理组合,以上每份处理50粒种子,处理后一半种子用于细胞学观察,一半土培,长出幼苗后调查苗高和胚根的数量.

1.2.2 形态学上对蚕豆多倍体诱导结果的鉴定

统计胚根诱导率和胚根膨大率,在形态上对蚕豆多倍体诱导结果进行鉴定.胚根膨大率(%)=(根尖膨大后离根尖2 cm处的周长-对照组相应位置的周长)/对照组相应位置的周长×100.根尖诱导率(%)=(诱导膨大的根尖/对照组根尖总数)×100[7].当蚕豆根尖处理到第10 d和第15 d时分别调查各处理组的胚根数量和苗高.

1.2.3 细胞学上对蚕豆多倍体诱导结果的鉴定

调查胚根细胞染色体数目、气孔及保卫细胞大小和数量,在细胞学上对蚕豆多倍体诱导结果进行鉴定.胚根细胞染色体数目的鉴定方法为:取各处理组胚根20条,用卡诺氏固定液固定10 h后用蒸馏水冲洗2～3 min,然后用l mol/L的盐酸在60℃水浴中解离20 min,蒸馏水洗涤3～5次,用刀片将蚕豆根尖纵切3～4片,最后用改良的苯酚品红溶液染色8～10 min,压片后在光学显微镜下观察[8,9].从每个处理中随机选择20个制片进行统计,共统计100个处于分裂中期的细胞以及其中染色体加倍的细胞.气孔及保卫细胞数量的鉴定方法为:各处理幼苗长出2～3片幼叶后,用刀片把第2片幼叶的上表皮及叶肉刮去,剩余的下表皮用改良的苯酚品红溶液染色,光学显微镜下观察气孔及保卫细胞的大小,并调查10×40倍光学显微镜下20个视野内的各处理平均气孔及保卫细胞的数目.

1.2.4 数据分析方法

用SPSS 13.0软件对实验数据进行统计分析,并用Duncan法进行多重比较.

2 结果与分析

2.1 秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆根尖诱导率的影响

秋水仙素不同处理浓度与处理时间下蚕豆根尖诱导率的统计结果见图1.由图1可以看出,蚕豆根尖诱导率随秋水仙素处理浓度的增加呈现先升高后降低的趋势.秋水仙素处理浓度为0.100%时,根尖诱导率最大;秋水仙素处理浓度为0.200%时,根尖诱导率最小;秋水仙素处理浓度为0.025%～0.100%时,根尖诱导率升高趋势明显;处理浓度为0.150%～0.200%时,根尖诱导率下降趋势明显.随处理时间的延长蚕豆根尖诱导率呈上升趋势,处理60 h时根尖诱导率最大,12 h时根尖诱导率最小,在12～48 h之间根尖诱导率变化明显,而48～60 h之间变化不明显.这表明蚕豆根尖诱导率在不同诱导时间和诱导浓度之间差异明显.这与郭英等[10]以及胡洲鹤等[11]研究结果相似.

把好加工关。按工艺流程规范操作，并做好以下几点：不使用腐败变质、含有毒有害物质的食品原料，不得回收餐厨废弃物；严格实行“生熟分开”，避免食品受到各种致病菌的污染；需要熟制加工的食品要做到“烧熟煮透”，其中心温度不得低于70℃，以保证杀灭食品中的有害微生物和有毒成分，对半成品和剩余食品进行二次烹调加工时，中心温度亦不能低于70℃；制定详细的清洗消毒制度及操作规程，严格实施清洗消毒程序；对高风险食品按规定程序进行留样。

2.2 秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆胚根膨大率的影响

秋水仙素不同处理浓度与处理时间下蚕豆胚根膨大率的统计结果见图2.由图2可知,随秋水仙素处理浓度的增加,蚕豆胚根膨大率呈先升高后降低的趋势.秋水仙素处理浓度为0.100%时,胚根膨大率最大;处理浓度为0.200%时,胚根膨大率最小;处理浓度为0.025%～0.100%时,胚根膨大率升高趋势明显;处理浓度为0.150%～0.200%时,胚根膨大率下降趋势明显.随处理时间的延长蚕豆胚根膨大率呈上升趋势,处理60 h时胚根膨大率最大,12 h时胚根膨大率最小,在12～48 h之间胚根膨大率变化明显,而48～60 h之间变化不明显.这表明蚕豆胚根膨大率在不同诱导时间和诱导浓度之间差异明显.这与闫秋洁等[7]研究结果相似.

图1 秋水仙素不同处理浓度与处理时间下蚕豆根尖诱导率

图2 秋水仙素不同处理浓度与处理时间下蚕豆胚根膨大率

2.3 秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆胚根细胞染色体数目的影响

调查发现,秋水仙素不同处理浓度与处理时间下,蚕豆胚根根尖细胞染色体有加倍现象,既有二倍体(2n=12),又有四倍体(4n=24)和八倍体(8n=48),但未发现异形染色体,也未发生染色体交叉丢失现象.这表明用秋水仙素诱导处理后除倍性发生变化外,染色体其余特征均与二倍体表现一致.这与陈高等[12]以及郑宝强等[13]研究结果相似.

2.4 秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆幼叶气孔数量的影响

秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆幼叶气孔数量的影响见图3.由图3可知,与对照相比,秋水仙素各种处理下,幼叶的气孔数量明显减少.在10×40倍显微镜下,处理组一个视野内平均气孔数约为3～4个,而对照组平均约5个.方差分析结果表明,气孔数量在不同的诱导时间、诱导浓度之间以及“时间×浓度”之间差异显著(见表1).多重比较结果表明,处理时间为12 h和24 h时差异不显著,48 h和60 h时差异也不显著,但12～24 h与48～60 h之间差异显著(见表2).处理浓度为0.025%时气孔数量最多,与0.050%,0.100%浓度下的气孔数量差异显著,0.100%时气孔数量最少,但与0.050%,0.150%和0.200%之间的气孔数量差异不显著.这与陈发棣等[14]、阎志红等[15]及王鸿鹤等[16]研究结果相似.

图3 各种处理下一个视野内的平均气孔数目(10×40倍显微镜下观察)

2.5 秋水仙素不同处理浓度下保卫细胞大小变化

10×40倍显微镜下观察到,在秋水仙素不同处理浓度下,处理组与对照组相比,保卫细胞均有不同程度地变大.在0.100%水平处理下保卫细胞最大.这与李晓艳等[17]研究结果相似.

2.6 秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆幼苗高度的影响

秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆幼苗高度的影响见图4、图5.对图4、图5数据进行方差分析和多重比较,分析结果见表1、表2、表3.由表1、表2、表3知,经秋水仙素处理10 d和15 d后,幼苗的高度在各处理时间之间以及“时间×浓度”之间差异不显著,但各处理浓度之间差异显著,并且随着处理浓度升高苗高呈降低趋势.秋水仙素处理10 d后,苗高在0.025%时最高,在0.200%时最低.苗高在0.100%和0.150%之间差异不显著,其他处理浓度之间差异均显著.秋水仙素处理15 d后,2个相邻的处理浓度之间无显著差异,但相隔的处理浓度之间有显著差异.这与陈绍潘等[18]及匡全等[19]研究结果相似.

2.7 秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆幼苗胚根数量的影响

秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆胚根数量的影响结果见表1、表2、表3.由表1、表2、表3知,经秋水仙素处理10 d和15 d后,胚根数量在各处理时间之间、各处理浓度之间以及“时间×浓度”之间差异不显著,但对照组与各处理组之间差异极显著.即在秋水仙素处理下,蚕豆幼苗胚根生长严重受到抑制.这与张素芝等[20]研究结果相似.

图4 10 d后各处理下的幼苗高度

图5 15 d后各处理下的幼苗高度

表1 秋水仙素不同处理时间和处理浓度下各变量的方差分析

2.8 秋水仙素诱导蚕豆多倍体的最佳“处理时间×处理浓度”组合的确定

秋水仙素诱导蚕豆多倍体的处理浓度和处理时间之间的互作见表1.由表1可以看出,在2种因素共同作用下,根尖诱导率和胚根膨大率与对照相比均达到显著水平,再结合多重比较结果,确定秋水仙素诱导蚕豆多倍体的最适处理时间为48 h,最佳处理浓度为0.100%.

3 讨论

本实验结果表明,在秋水仙素处理下,蚕豆根尖诱导率、胚根膨大率升高,根尖细胞染色体数目增多,气孔数量减少,保卫细胞变大,胚根数量减少,幼苗高度降低.蚕豆根尖诱导率、胚根膨大率、气孔数量在秋水仙素不同处理浓度、不同处理时间、不同“处理时间×处理浓度”组合之间差异显著.胚根数量、幼苗高度在秋水仙素不同处理时间、不同“处理时间×处理浓度”组合之间差异不显著,但不同处理浓度之间差异显著.秋水仙素诱导蚕豆多倍体的最适处理时间为48 h,最佳处理浓度为0.100%.

表2 秋水仙素不同处理时间下各变量的多重比较

表3 秋水仙素不同处理浓度下各变量的多重比较

秋水仙素是一种作用于微管的特异性生物碱,秋水仙素能抑制有丝分裂,破坏纺锤体,使染色体停滞在分裂中期.秋水仙素有剧毒,处理太长时间会对处理的植物产生毒害作用,但秋水仙素不论是破坏还是抑制纺锤体的形成,作用都是一时的,去除秋水仙素后细胞可以恢复正常的分裂[21].从实验结果可以看出,当秋水仙素处理浓度一定时,植株细胞加倍率会随处理时间的延长呈现上升的趋势,在处理时间一定时,细胞染色体的加倍率会随浓度的上升而呈现出先上升后下降的趋势,所以应权衡诱导时间和诱导浓度之间的平衡,选择最适宜的组合进行处理.

本实验中秋水仙素溶液处理蚕豆胚根的最佳浓度是0.100%,最佳时间是48 h.这是因为秋水仙素对植株细胞有一定的毒害作用,诱导浓度过大或诱导时间过长都会影响到植株的正常生长,既不会诱导发芽,也不会诱导膨大.多倍体诱导的细胞学鉴定表明染色体会加倍,在二倍体的基础上出现了四倍体和八倍体.这是因为秋水仙素抑制了纺锤丝的形成,导致染色体不能移向两级,故出现了染色体加倍的情况[21].表型特征反映遗传特征,表型变异特征可作为鉴定的一个形态学指标来反映遗传特征[22].用秋水仙素处理后,保卫细胞数量减少,体积变大,这是因为秋水仙素诱导染色体加倍,细胞核的体积增大,各种细胞器也随之增大,故保卫细胞增大.秋水仙素浓度过高时会抑制胚根的形成和发育从而影响胚根的数量,而胚根的数量和植物吸收矿质元素息息相关,会影响到植株的生长发育.处理组的苗高和胚根数量明显低于空白组,是因为有些残留在组织内的秋水仙素比较容易向植物分生组织中运输积累,抑制了茎的分生生长.但是这些形态变异是否会影响到多倍体植株的生殖发育,是否能形成稳定的多倍体后代,仍需进一步研究.

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