生防枯草芽孢杆菌B29对黄瓜根际功能细菌及土壤酶活性的影响

高吉坤，孙雨薇，曹 旭，于丽萍，李 晶*

(1.长春恒晨生物科技有限责任公司，吉林长春 130000;2.东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150080;3.黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨 150010)

土壤是农业生态系统中物质与能量交换的枢纽，而土壤微生物是土壤生态系统中重要的功能群体，担负维持土壤生态系统的稳定、加快土壤生态系统中养分的循环和提高土壤对不良环境的抵御能力，也是预防土传病害的关键所在［1］。土壤中一切物质转化都有酶的参与。土壤酶大部分来自于土壤微生物，因此与土壤微生物有密切关系。影响土壤微生物活性的因素也必然影响酶的活性。

枯草芽孢杆菌B29菌株不仅对黄瓜枯萎病具有明显的防治效果，而且灌根施用后可使黄瓜根际土壤向“细菌型”土壤转化［2］。在此基础上，笔者又探讨了该菌株对黄瓜根际几种主要功能细菌和土壤酶活力的影响，为枯草芽孢杆菌B29菌剂在农业生产中的应用提供微生态依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 枯草芽孢杆菌B29菌液的制备。枯草芽孢杆菌B29是由黑龙江省科学院微生物研究所在黄瓜根围土壤中分离、纯化、保存。将活化好的枯草芽孢杆菌B29菌株按2%接种量转接于50 ml的NYD液体培养基中，30℃150 r/min条件下培养48 h，采用平板稀释计数法测定菌数为5.75×108cfu/ml，备用。

1.1.2 供试植株。哈尔滨市群力开发区小西屯保护地春季移栽黄瓜。

1.2 方法

1.2.1 试验处理。春季黄瓜移栽时，随机分为3组。①生防菌B29菌剂处理组，将B29菌原液稀释至5.75×107cfu/ml，灌根处理，每株灌根250 ml，共处理60株;②化学农药处理组，将浓度75%百菌清4 g加水稀释至25 L，灌根处理，每株灌根250 ml，共处理60株;③空白对照组，每株黄瓜用清水灌根250 ml，共处理60株。

自黄瓜移栽当天算起，移栽后10、20、30、40 d分别取土样。将植株根围表土除去，取3～6 cm深且靠近植株根系土壤约40 g。每个实验组随机采取10株黄瓜根际土样，分别装到已消毒的封口袋中，做好标记，－20℃保存，待测。

1.2.2 黄瓜根际部分功能细菌数量的测定。

1.2.2.1 氨氧化细菌数量的测定。先将氨氧化细菌培养液加到试管中，每个试管加5 ml，共25个试管，再将已稀释好的土壤菌悬液(5个梯度，每个梯度5次重复)1 ml加到装有培养液的试管中，放在28～30℃培养箱中培养28 d后，向每只试管中滴入Griess.Ilosvay试剂1～2滴，若由红色变为褐色，则说明该试管中有氨氧化细菌生长，采用最大或然数法计算出土壤样品中氨氧化细菌数量。

1.2.2.2 亚硝酸氧化细菌数量的测定。先将亚硝酸氧化细菌培养液加到试管中，每个试管加5 ml，共25个试管，再将已稀释好的土壤菌悬液(5个梯度，每个梯度5个重复)1 ml加到装有培养液的试管中，放在28～30℃培养箱中培养9 d后，向试管中加0.3 ml浓硫酸和0.3 ml硫酸联苯胺溶液，若呈现深蓝色，则说明没有发生脱氮作用，记录变色试管数，采用最大或然数法计算出土壤样品中亚硝酸氧化细菌数量。

1.2.2.3 好气性纤维素分解菌数量的测定。先将好气性纤维素分解菌培养液加到试管中，每个试管加5 ml，共25个试管，再将已稀释好的土壤菌悬液(5个梯度，每个梯度5次重复)1 ml加到装有培养液的试管中，然后将备用的滤纸贴于试管内壁，一半浸入培养液内，一半在培养液外，放在28～30℃培养箱中培养5 d后，观察且记录结果，而后按稀释比率法计数。

1.2.3 黄瓜根际部分土壤酶活性的测定。脲酶采用苯酚钠次氯酸钠显色法测定;过氧化氢酶活性采用滴定法测定法测定;酸性磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定;蔗糖酶活性采用 3，5－二硝基水杨酸比色法测定［3］。

2 结果与分析

2.1 根际功能细菌数量变化

2.1.1 氨氧化细菌。氨氧化细菌又被称亚硝酸细菌，是土壤中氮素转化的重要参与菌株。它可将氨氧化成亚硝酸，是硝化作用的第一步，也是限速步骤。氨氧化细菌是土壤中氮素循环的关键氧化物质，在土壤氮素转化中有着不可替代的作用［4］。

由图1可知，在黄瓜移栽后10、20 d时，经枯草芽孢杆菌B29菌剂处理过的黄瓜根际土壤中氨氧化细菌数量高于对照组，且差异在0.01水平显著;百菌清药液处理后黄瓜根际的氨氧化细菌数量在第10天时明显低于对照组，且差异在0.01水平显著。比较化学杀菌剂处理组与菌剂处理组根际氨氧化细菌数量，可以看出在黄瓜移栽后10、20 d，生防菌剂处理组数量要明显高于化学农药处理组，差异在0.01水平显著。在处理第30、40天时，氨氧化细菌数量在各处理组间已无明显差异，此时氨氧化细菌数量已基本不受百菌清药液的影响，枯草芽孢杆菌B29菌剂处理组此时对氨氧化细菌的生长已无明显的促进作用。由此可知，枯草芽孢杆菌B29的施加在黄瓜生长前期可以促进黄瓜根系土壤中氨氧化细菌的生长，并且能及时地供给植物所需氮素，促进植物的生长;化学杀菌剂的施加不利于氨氧化细菌的生长，在施加一段时间后氨氧化细菌数量已基本恢复到初始时的数量。

2.1.2 亚硝酸氧化细菌。亚硝酸氧化细菌又称硝酸细菌，可将土壤中的亚硝酸盐氧化成可被植物吸收利用的硝酸盐，进而提高了土壤中可被利用氮素的含量。图2为不同处理组黄瓜根际土壤中亚硝酸细菌在不同时间的数量变化。从生防菌B29菌剂处理后的10、20 d的测定结果可以看出，生防菌B29菌剂处理过的黄瓜根际土壤中亚硝酸氧化细菌要明显高于其他两组，且差异在0.01水平显著，说明短时间内生防菌B29施加能促进黄瓜根系土壤中亚硝酸细菌的生长;在10、20 d时，化学杀菌剂处理组的亚硝酸细菌数量要明显低于生防菌B29处理组，且差异在0.01水平显著;与对照组相比，在10、20 d时化学农药处理组亚硝酸氧化细菌数量要低于空白组，在10 d时亚硝酸氧化细菌数量明显低于空白组，且差异在0.05水平显著，由此可知化学农药的施加会抑制亚硝酸氧化细菌的生长;在处理30 d后，各组差异不显著，此时生防菌B29和化学农药对亚硝酸氧化细菌的影响已基本解除。

2.1.3 好气性纤维素分解菌。好气性纤维素分解菌是土壤中一种主要的功能细菌。它可将纤维素分解成葡萄糖，增加土壤中有机碳的含量，分解产物葡萄糖可被作物根系吸收利用。纤维素分解菌的数量可以从侧面反映土壤中有机碳源的含量，是土壤肥力的一个生物指标。

图3表示不同处理黄瓜根际土壤中好气性纤维素分解菌的数量随时间变化的趋势。在施加生防菌后第10、20天测得的好气性纤维素分解菌的数量均高于其他两组，且差异在0.05水平显著，随着好气性纤维素菌数量的增多，土壤内有机碳含量也会相应增加，土壤肥力提高，同时为植物提供生长所必需的养分，促进植物的生长;在处理30 d后，各处理组好气性纤维分解菌数量差异不显著，此时生防菌B29菌剂对好气性纤维分解菌已无影响。在处理后不同时间段，化学杀菌剂处理组的好气性纤维分解菌数量均与对照组无差异。

2.2 不同处理后黄瓜根际土壤酶活性变化

2.2.1 脲酶。脲酶是氮转化的关键酶。它主要来源于微生物和植物代谢，其活性的变化主要取决于土壤中氮元素的含量［5］。

不同处理对土壤中脲酶活性的影响见图4。生防菌B29菌剂的施加能促进提高脲酶活性，在处理后第10、20天生防菌B29处理组脲酶活性高于其他2个处理组，且差异均在0.01水平显著，说明生防菌B29的施加在黄瓜生长前期有利于提高脲酶活性;化学杀菌剂处理组土壤中脲酶活性在黄瓜生长前期(移栽后10、20 d)在0.01水平显著低于生防菌剂处理组和对照组，在黄瓜生长后期(移栽后30～40 d)化学杀菌剂处理组与其他两组中的脲酶活性已无明显差异，此时化学杀菌剂和生防菌B29对脲酶活性都已无明显影响，说明化学杀菌剂在黄瓜生长前期(移栽后10、20 d)内会降低土壤中脲酶活性，后期脲酶活性恢复到与对照组基本一致的水平。

2.2.2 过氧化氢酶。过氧化氢酶是一种稳定的氧化物分解酶，能将过氧化氢分解成水和氧气，进而解除过氧化氢对植物的毒害作用。不同处理对土壤中过氧化氢酶活性的影响见图5。在施加生防菌B29后，黄瓜根际土壤中过氧化氢酶活性在短期内(10、20 d)在0.01水平显著高于空白对照组和百菌清药液处理组，且为百菌清药液处理组酶活性的1.7倍以上;随着黄瓜的生长发育，生防菌B29处理组的土壤中过氧化氢酶活性略有下降;在施用30 d后，生防菌B29处理组与其他2组相比差异均不显著，此时生防菌B29对土壤中过氧化氢酶活性已无显著影响;百菌清药液处理后10 d，黄瓜根际土壤中过氧化氢酶活性在0.01水平显著低于空白对照组。由此可知，枯草芽孢杆菌B29菌剂对黄瓜根际过氧化氢酶活性的提高有促进作用，而化学杀菌剂则对黄瓜根际过氧化氢酶活性有较明显的抑制作用。

2.2.3 蔗糖酶。蔗糖酶又称“转化酶”，是糖苷酶之一，可将蔗糖催化为果糖和葡萄糖的一种分解酶，广泛存在于微生物和动植物体内，主要受温度、底物浓度的影响。从图6可以看出不同处理对土壤中蔗糖酶活性的影响。在黄瓜生长初期(10、20 d)，生防菌B29处理组测蔗糖酶活性要明显高于其他2组处理，且差异在0.01水平显著，说明生防菌B29菌剂施加一定时间(20 d)内可以提高土壤中蔗糖酶的活性;在黄瓜生长初期(10 d)，施加化学杀菌剂组土壤中蔗糖酶活性在0.05水平显著低于空白组中蔗糖酶活性，说明化学杀菌剂的施加抑制了蔗糖酶活性，不利于植物根系的养分吸收。随着处理后时间的推移，生防菌B29和化学杀菌剂对黄瓜根际蔗糖酶活性的影响均不再体现。

2.2.4 磷酸酶。土壤中的磷酸酶是一类能参与土壤中有机磷化合物合成的一种酶，其活性主要由土壤中微生物数量、种类及植被所影响。磷酸酶活性是鉴定土壤肥力一项重要指标。从图7可以看出，在施加生防菌B29后30 d内磷酸酶活性在0.01水平显著高于其他两组，说明生防菌的施加促进土壤内无机磷盐的溶解，提高土壤肥力，进而缓解植物在生长期对磷元素的需求;在施用40 d时，磷酸酶活性与空白组相比无差异，说明此时生防菌B29已不再影响磷酸酶活性。施加化学杀菌剂组的磷酸酶活性在10 d时在0.01水平显著低于空白组，此时化学农药对磷酸酶活性有明显的抑制作用，但在以后的时间段(20、30、40 d)其酶活性与空白组无差异。

3 讨论

研究表明，施加枯草芽孢杆菌B29后，前期(10、20 d)土壤内氨氧化细菌数量要明显高于空白组，后期(30、40 d)其数量与对照组基本一致。亚硝酸氧化细菌、好气性纤维素分解菌变化规律亦是如此。由此可知，枯草芽孢杆菌B29的施加能促进黄瓜根际土壤中功能细菌的生长。化学杀菌剂处理组土壤中氨氧化细菌、亚硝酸细菌的数量在前期(10、20 d)时在0.05水平显著低于空白组。该结果与张桂山［6］在多菌灵、呋喃丹对湖南红壤土壤微生物和酶活性效应的研究结果一致，即施加多菌灵后的一段时间内对土壤中硝化细菌生长有明显的抑制作用;好气性纤维素分解菌则受影响不大，在整个生长周期中与空白组数量差异不显著。由此可知，化学杀菌剂的施加对土壤中部分功能细菌的生长有抑制作用。

而施加枯草芽孢杆菌B29有利于提高土壤中脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶的活性，且这些土壤酶活性随时间的变化趋势基本一致，均为先升高后降低。该结果与王辉［7］辣椒疫病生防ASD菌株对土壤微生态调控机理研究结果基本一致，即ASD菌株施加到辣椒根围土壤后，土壤脲酶活性、酸性磷酸酶活性、蔗糖酶活性及脱氢酶活性均有不同程度的提高，只有过氧化氢酶活性提高不显著。罗珍等［8］在接种AM真菌对玉米秸秆降解及土壤微生物量碳、氮和酶活性的影响中指出，接种AF真菌到玉米根际，对土壤中酸性磷酶、过氧化氢酶活性和蛋白酶活性均有显著提高，形成明显不同于非根际的微生物区系。刘慧芬［9］在刺槐根瘤固氮菌放氢对根际土壤微生物的影响研究中发现，刺槐根瘤固氮放氢能提高土壤微生物代谢强度，脱氢酶、过氧化氢酶、脲酶、转化酶等土壤酶活性有显著的升高。魏海燕［10］在枯草芽孢杆菌、春雷霉素对黑土微生物的生态影响中指出，各质量分数处理的春雷霉素对土壤中的细菌、真菌和放线菌均有促进生长的作用，且25 000、50 000 mg/kg处理组的促进作用最为明显，由此得知生防菌的施加有利于土壤酶活性的提高，间接地促进微生物生长，增加土壤中微生物的生物量，对土壤肥力的提高、健康程度的增加都有积极的促进作用。研究中，化学杀菌剂百菌清施用后10、20 d，黄瓜根际土壤脲酶活性要显著低于空白组，过氧化氢酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶活性在处理10 d时在0.05水平显著低于空白组，说明化学杀菌剂对土壤酶活性有抑制作用。土壤酶活性是土壤质量的主要参数之一。土壤酶活性降低也间接导致土壤质量肥力变差，因此在农业生产中应尽量避免施加化学杀菌剂，以减少其带来的危害。

由此可知，生防菌不仅抑制病菌的繁殖，而且可以有效改善作物根际微生态环境。它作为植保新途径为生态农业的发展注入新活力。

［1］DORAN J W，COLEMAN D C，BEZDICEK D F，et al.Defining soil quality for a sustainable environment［J］.American Journal of Alternative Agriculture，1995，10:46 －47.

［2］高吉坤，曹旭，于丽萍，等.枯草芽孢杆菌B29对黄瓜根际土壤微生物的影响［J］.安徽农业科学，2013，41(7):2922 －2923，2947.

［3］周礼恺，张志明.土壤酶活性的测定方法［J］.土壤通报，1980(5):37－38，49.

［4］余泺，高明，慈恩，等.不同耕作方式下土壤氮素矿化和硝化特征研究［J］.生态环境学报，2010(3):733 －738.

［5］潘丹丹，张志卿.四川丘陵区典型边坡土壤酶活性的季节动态［J］.水土保持通报，2013(1):111－114.

［6］张桂山.多菌灵、呋喃丹对湖南红壤微生物和酶活性的效应及多菌灵降解细菌的分离鉴定与降解性研究［D］.杭州:浙江大学，2004.

［7］王辉.辣椒疫病生防ASD菌株筛选及对土壤微生态调控机理研究［D］.沈阳:沈阳农业大学，2012.

［8］罗珍，朱敏，王晓锋，等.分根装置中接种AM真菌对玉米秸秆降解及土壤微生物量碳、氮和酶活性的影响［J］.中国生态农业学报，2013(2):59－63.

［9］刘慧芬.刺槐根瘤固氮放氢对根际土壤微生物的影响［D］.西安:西北大学，2010.

［10］魏海燕.枯草芽孢杆菌、春雷霉素对黑土微生物的生态影响［D］.乌鲁木齐:新疆农业大学，2009.