槐豆总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究

任顺成，王 玮

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

槐豆（Sophora japonica L.）是槐角的别名，为国槐树的果实，具有凉血、止血、清热泻火的功效[1].它富含类黄酮和异黄酮类化合物，含有槐属苷、槐属双苷、山柰酚糖苷-C、槐属黄酮苷和芸香苷等，其中芸香苷的含量较高[2].槐豆也含有人体必需的氨基酸、亚麻酸、磷酯、胶原蛋白、亚油酸和多种微量元素[3]，可以调节血脂、降低血压，在促进身体各系统清除垃圾方面有显著效果.

黄酮类化合物是植物通过光合作用产生的多酚类的次级代谢产物，因具有酚羟基而成为一种很强的抗氧化剂，有改善血液循环，降低胆固醇的药效.但黄酮类化合物的种类较多且结构相似，对于不同的自由基，其清除的机理有所不同，清除不同的自由基存在选择性，因此对各种自由基所表现出的清除能力也有强有弱[4].黄酮类化合物作为槐豆中的重要活性成分，已成为人们最为关注的一种天然的自由基清除剂，研究乙醇提取槐豆总黄酮的工艺条件及其抗氧化活性具有重要意义.本文采用分光光度法进行检测，以期为槐豆资源的合理开发利用提供理论参考依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

槐豆：采集于郑州栽培的国槐，晾干保存.

1.2 主要仪器与设备

SHX-D(Ⅲ)循环水式真空泵:巩义市予华仪器有限责任公司；101FX-1 电热鼓风干燥箱:上海树立仪器仪表有限公司；752 紫外可见分光光度计:上海菁华科技仪器有限公司.

1.3 试验方法

黄酮类化合物在乙醇和甲醇等极性溶剂中溶解能力大，在非极性溶剂中溶解能力小.黄酮类化合物与AlCl3溶液反应产生络合物，有荧光出现，并且颜色大部分为黄色.利用该性质测定黄酮类化合物含量.

1.3.1 黄酮的提取工艺流程

工艺流程:槐豆干燥→粉碎后过80 目筛→乙醇回流热提取→真空抽滤→滤液定容→待测样液.

为了保证在试验过程中乙醇浓度和体积不变，本试验采用冷凝回流的方法.

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

以芦丁为标准品，采用AlCl3显色法测定槐豆中黄酮类化合物含量[5-6].

精确称取芦丁标准品2.5 mg，用甲醇溶解，于25 mL 容量瓶中定容，得到质量浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液，精确吸取芦丁标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 并分别置于25 mL 容量瓶中，分别加入20 mL 0.1 mol/L AlCl3甲醇溶液，定容，摇匀，10 min 后在420 nm 处测定吸光度（A）.以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线.经统计分析，得回归方程:

式中：A 为吸光度；X 为黄酮质量浓度，μg/mL.

1.3.3 槐豆总黄酮的提取

称取1 g 槐豆干粉，按照试验设计条件加入一定量的提取剂，提取一定时间后趁热减压抽滤.滤液用90%的乙醇定容于100 mL 的容量瓶中摇匀，避光保存待测.

1.3.4 槐豆总黄酮含量的测定

用移液管移取2 mL 槐豆提取滤液于25 mL容量瓶中，加20 mL 0.1 mol/L AlCl3甲醇溶液，用90%的乙醇定容，摇匀，10 min 后，在波长420 nm处测定吸光度.依据标准曲线回归方程计算出提取滤液中槐豆总黄酮的浓度c (μg/mL)，并按下列公式计算槐豆总黄酮的得率.

总黄酮得率（mg/g）=黄酮类化合物的质量（mg）/槐豆粉的质量（g）.

1.3.4.1 单因素试验

以提取时间、提取温度、乙醇浓度和料液比为主要考察因素进行试验.提取时间选取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 6 个水平，提取温度选取40、50、60、70、80、90 ℃6 个水平，料液比选取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶256 个水平，乙醇浓度选取30%、40%、50%、60%、70%、80% 6 个水平，分别进行单因素试验.

1.3.4.2 正交试验

根据单因素试验结果，以总黄酮得率为考察指标，对上述四因素进行正交试验，考察各因素对槐豆总黄酮得率的影响，得出最佳工艺条件.

1.3.5 槐豆总黄酮抗氧化活性的测定

在波长510 nm 处对上述槐豆总黄酮提取液的吸光度进行测定，根据芦丁标准曲线计算出总黄酮浓度，将待测液45 ℃旋蒸，浓缩至一定浓度后，提取液用70%的乙醇溶液适当稀释得到黄酮浓度为20、40、60、80、100 μg/mL 的提取液，作为不同浓度槐豆总黄酮类化合物的样品液.

2.2.3 角尺度 角尺度用来描述相邻树木围绕参照树的均匀性，用角尺度描述林木个体在水平地面上的分布形式，或者说种群的空间分布格局(描述非规则性)。任意2个邻接最近相邻木的夹角有2个，小角为α，最近相邻木均匀分布时的夹角设为标准角α0。对于n=4，标准角的可能取值范围为(60°，90°)，最优标准角为72°[11]。角尺度被定义为α角小于标准角α0的个数占所考察的n个夹角的比例，其表达式式中：Wi为第i株参照树的角尺度；Zij为离散性变量，其值定义为，当第j个α角小于标准角α0时，Zij=1，否则式中：W为树种或林分平均角尺度；N为树种或林分的林木总株数。

1.3.5.1 对[DPPH·]清除能力的测定

测定方法参照文献[7-9].取洁净试管，加入2 mL 0.1 mmol/L 的[DPPH·]溶液和2 mL 不同浓度的黄酮待测溶液、Vc 溶液，用分光光度法测定，在波长517 nm 处测定体系的吸光度值Ai.用95%的乙醇溶液代替[DPPH·]溶液，测定吸光度值为Aj.用95%的乙醇溶液代替样品溶液重复试验，进行测定的吸光度值为A0.按下面公式计算样品的清除率.

式中：Ai表示2 mL[DPPH·]溶液+2 mL 黄酮提取液的吸光度；Aj表示2 mL 95%的乙醇溶液+2 mL 黄酮提取液的吸光度；Ao表示2 mL [DPPH·]溶液+2 mL 95%乙醇的吸光度.

1.3.5.2 对羟自由基[·OH]清除能力的测定

测定方法参照文献[10-12]，在25 mL 比色管中依次加入6 mmol/L FeSO42 mL，6 mmol/L 水杨酸2 mL 及不同浓度的黄酮提取液、Vc 溶液2 mL加蒸馏水至8 mL，最后加2 mL 6 mmol/L 过氧化氢来启动反应，摇匀后于37 ℃水浴加热反应15 min.在510 nm 波长下测量各浓度的吸光度值Ai，并以蒸馏水为参比.清除率计算公式:

式中：Ao为空白对照液的吸光度；Ax为加入黄酮提取液后的吸光度；为不加H2O2黄酮提取液本底的吸光度.

1.3.5.3 对超氧阴离子[O2－·]的清除作用

测定方法参照文献[13-15]，将4.7 mL Tris-HCl（pH=8.0）置于10 mL 具塞试管中，并在25 ℃水浴中加热20 min，分别加入不同浓度的黄酮提取液0.1 mL，均加入0.2 mL 邻苯三酚，混匀，水浴4 min 后将样品取出，加入1 滴10 mol/L 盐酸终止反应，在320 nm 处测定样品吸光度Ax.以甲醇为代替样品，测得空白对照吸光度A0.用Vc 作为对照品.按照下面的公式计算，得到不同黄酮浓度下对超氧阴离子自由基的清除率.

式中:Ao为空白对照液的吸光值；Ax为加入黄酮提取液后的吸光值.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间的选择

在提取温度70 ℃、乙醇体积分数60 %、料液比1∶20 的条件下进行提取时间的单因素试验，结果见图1.

图1 提取时间对总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids

由图1 可知，提取时间为2 h 时，总黄酮得率最高，在0.5～2 h 时，总黄酮得率随提取时间的增加而逐渐增加，呈现出较好的量效关系.2.0～3.0 h时，总黄酮得率略有下降，其原因可能是溶于乙醇溶液中的槐豆黄酮类化合物长时间的加热，导致部分热不稳定的黄酮类物质的分解或转化，最终总黄酮减少.考虑产品纯度、黄酮得率、能源消耗等，因此选择提取时间为2 h.

2.1.2 提取温度的选择

在提取时间2 h、乙醇体积分数60%、料液比1∶20（g/mL）的条件下进行温度的单因素试验，结果见图2.

图2 提取温度对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids

由图2 可知，提取温度为80 ℃时，总黄酮得率最高.提取温度为40～80 ℃，槐豆总黄酮得率随提取温度的增加逐渐增大，当温度高于80 ℃，总黄酮得率略有下降.由于温度升高导致槐豆中的部分热敏性黄酮类物质损失[16]，高温还有助于分子的运动，增加了黄酮向细胞外的溶出率[17]，从而使得总黄酮得率有所下降.综合考虑，选择提取温度为80 ℃.

2.1.3 料液比的选择

在提取时间2 h、乙醇体积分数60%、温度为80 ℃的条件下进行料液比的单因素试验，结果见图3.

图3 料液比对总黄酮得率的影响Fig.3 Effects of material-liquid ratio on the yield of total flavonoids.

由图3 可知，料液比为1∶25 时，总黄酮得率最高.料液比在1∶5～1∶25 时，槐豆总黄酮得率随料液比的增大而增大，当料液比高于1∶25 时，槐豆总黄酮得率趋于稳定.可能由于回流提取是一种传质扩散过程，在料液比较小时，有效成分尚未完全溶出而溶液已达到饱和.料液比高于1∶25，此时，黄酮大部分已经溶出，槐豆黄酮的得率趋于稳定.综合考虑，选择料液比为1∶25.

2.1.4 乙醇体积分数的选择

在提取时间2 h、料液比1∶25、温度为80 ℃的条件下进行乙醇体积分数的单因素试验，结果见图4.

图4 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

由图4 可知，乙醇体积分数为60%时，总黄酮得率最高.乙醇体积分数在30%～60%时，随着体积分数增加，槐豆总黄酮得率呈增加趋势.乙醇体积分数增至70%时，槐豆总黄酮得率略有降低但差别不大，当增至80%时降低幅度明显.这可能是由于槐豆中的黄酮类物质的大部分是黄酮苷类物质.当乙醇体积分数增大时，部分醇溶性黄酮能较好地溶出.但当乙醇体积分数较大时，水溶性黄酮的溶解度会降低.综合考虑，选取乙醇体积分数为60%.

2.2 槐豆总黄酮提取工艺的优化

在以上单因素试验的基础上，设置四因素三水平进行L9（34）正交试验，考察各因素对总黄酮提取得率的影响，结果见表1，显著性分析见表2.

由表1 可以得出，以槐豆总黄酮得率为判断指标，各因素对槐豆总黄酮得率影响的大小顺序为乙醇体积分数＞提取温度＞料液比＞提取时间.经SPSS 软件对数据进行显著性分析，表2 中乙醇体积分数的F 值极显著，其余几个因素的F 值均不显著.

从实际生产效益、经济成本和溶剂回收角度考虑，提取时间作为影响最小的因素可以选择2 h，因此最优组合为A3B2D1C2.最佳的工艺条件为乙醇体积分数70%，提取温度80 ℃，料液比1∶20，提取时间2 h，在此工艺条件下，总黄酮提取率较高.

表1 正交试验结果Table 1 Results of orthogonal experiment

表2 总黄酮得率的显著性分析Table 2 Significant analysis of total flavonoids yield

2.3 验证试验

在提取温度为80 ℃、提取时间为2.0 h、料液比为1∶20、乙醇体积分数70%的条件下做验证试验，槐豆总黄酮平均得率为12.61 mg/g，6 次重复测定的相对标准偏差为0.017 %，表明重复性好，测定结果可靠.

2.4 槐豆黄酮氧化活性测定

2.4.1 槐豆黄酮清除[DPPH·]的能力（图5）

由图5 可知，槐豆黄酮提取液在20～40 μg/mL范围内的清除率增长较快.在40～100 μg/mL 范围内线性较好，呈量效关系，但增长缓慢.在试验条件下的最大清除率可达91.6%，槐豆黄酮提取液的抗氧化能力显著高于VC，表明其具有较强的对[DPPH·]的清除能力.

2.4.2 对羟自由基[·OH]清除能力的测定（图6）

由图6 可知，槐豆总黄酮提取液在20～40 μg/mL范围内，对[·OH]表现出一定的清除效果.在20～100 μg/mL 范围内，随浓度的增加，对[·OH]的清除率呈增长趋势.在试验条件下的最大清除率可达71.4%，对比Vc 清除羟自由基的能力可知，槐豆黄酮对羟自由基具有较强的清除能力.

图5 黄酮提取液对[DPPH·]的清除作用Fig.5 [DPPH·]-scavenging activity of flavonoids extract

图6 黄酮提取液对羟自由基[·OH]的清除作用Fig.6 [·OH]-scavenging activity of flavonoids extract

2.4.3 槐豆黄酮对超氧阴离子自由基[O2－·]的清除作用（图7）

由图7 可知，槐豆黄酮提取液在 20～100 μg/mL 范围内，槐豆总黄酮对[O2－·]具有比较好的量效关系.20～40 μg/mL 的范围内，随浓度的增加，对[O2－·]的清除作用增强不明显，在40～100 μg/mL的范围内随浓度的增加，对[O2－·]的清除率增强较明显.在试验条件下的最大清除率可达70.6%，对比Vc 清除超氧阴离子的能力可知，槐豆黄酮对超氧阴离子具有较强的清除能力.

图7 黄酮提取液对超氧阴离子自由基[O2－·]的清除作用Fig.7 [O2－·]-scavenging activity of flavonoids extract

3 结论

本试验采用乙醇回流法提取槐豆总黄酮，其最佳工艺条件为乙醇体积分数70%、提取温度80℃、提取时间2.0 h、料液比（g/mL）1∶20，此条件下总黄酮得率为12.61 mg/g.槐豆总黄酮显示出较强的自由基清除能力，其清除能力强弱依次为1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基[DPPH·]、羟自由基[·OH]和超氧阴离子自由基[O2-·]，这种清除能力优于VC，且其抗氧化活性与黄酮浓度呈显著的量效相关关系.

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