开菲尔活菌型酸乳饮料的研制

李海燕

（1.光明乳业股份有限公司乳业研究院 华北研究所，北京 101300；2.乳业生物技术国家重点实验室 上海乳业生物工程技术研究中心，上海 200436）

开菲尔是一种原产自高加索地区的传统的酒精性发酵乳饮料，传统的开菲尔是由开菲尔粒发酵牛乳或羊乳而制成的一种含有气体和酒精风味的发酵乳制品。开菲尔粒外观呈乳白色或浅黄色，表面凸凹不平，呈花椰菜或珊瑚状的弹性块状物体，直径为1～30 mm。开菲尔粒表面上共生着多种乳酸菌和酵母菌，长期饮用可以调节人体肠道菌群，使乳酸菌成为肠道的优势菌群，形成人体的天然屏障，从而抑制病原菌的入侵。

本试验以干燥浓缩的开菲尔颗粒Kefir M为发酵剂，制备活菌型开菲尔酸乳饮料，并研究不同试验因素对产品品质的影响，确定最优工艺与配方。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无抗鲜牛奶：光明自有牧场；羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose，CMC）、高甲氧基果胶：乔富企业有限公司；蔗糖：广西农垦糖业集团股份有限公司；开菲尔发酵剂Kefir M：丹尼斯克（中国）菌种有限公司；菌种组成包含乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp.lactis）、乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（Lactococcus lactissubsp.Lactis biovar.diacetylactis）、肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides）、嗜热链球菌（Streptococcus thermonphilus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。孟加拉红培养基（蛋白胨0.05%、葡萄糖1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、琼脂2%、孟加拉红溶液0.1 L、氯霉素0.1%、蒸馏水1 L），MRS培养基（蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、磷酸氢二铵0.2%、葡萄糖3%、吐温80 0.1%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.05%、硫酸锰0.02%、琼脂2%、蒸馏水1L）。

1.2 仪器与设备

CP124S电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；APV-1000均质机：丹麦APV公司；EUROSTAR搅拌器：德国IKA公司；PHB-4型精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；Water Baths恒温水浴锅：德国GFL公司；320A/C黏度计：美国BROOKFIELD公司；超净工作台：北京冠鹏净化设备有限责任公司；GNP-9080型防水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酸乳饮料工艺流程

鲜牛乳+蔗糖→预热溶解→混合均匀→均质→杀菌→冷却→接种→发酵→后熟→破乳搅拌→加入糖和稳定剂的混合溶液→搅匀→调酸→二次无菌均质→冷却→灌装

1.3.2 操作要点

发酵剂发酵温度的确定：开菲尔发酵剂的发酵温度一般在23～30 ℃，采用不同的发酵温度，确定适宜制作开菲尔酸乳饮料的最佳发酵温度。

发酵剂添加量的确定：发酵剂以0.2 U/kg的添加量，按无菌操作添加，搅拌5 min混匀后发酵。

配料、均质、杀菌：将生牛乳升温至50～60 ℃，加入蔗糖，搅拌15 min混匀。均质温度为60～65 ℃，压力为18～22 MPa，按照优选出的发酵剂添加量与发酵温度发酵，待发酵终点达到80～100°T时终止发酵，冰水冷却后搅拌，4 ℃冷藏备用。

稳定剂的溶解：将CMC和高甲氧基果胶按照一定比例混合，与蔗糖混合均匀，溶解于65 ℃的净化水中，搅拌20 min混合均匀，经95 ℃、保温5 min杀菌，冷却至40 ℃以下备用。

调酸：将发酵乳加入稳定剂溶液中混合均匀，待混合液降至20 ℃以下时，保持高速搅拌，将柠檬酸溶解于10倍蒸馏水后，缓慢加到发酵乳和稳定剂的混合液中，加酸结束后保持搅拌10 min，最终保持成品的pH值为4.10～4.20为宜。

二次均质：经试验，确定二次均质温度为20～30 ℃，压力为18～20 MPa时产品的稳定性较好。

灌装：均质后的产品冷却至2～6 ℃，灌装、冷藏。

1.3.3 分析与检测

保质期内酸度的测定：参考文献[7]，采用吉尔涅尔度（°T）。

保质期内乳酸菌活菌数的测定：开菲尔酸乳饮料于4 ℃冷藏，测定乳酸菌活菌数。将饮料用灭菌生理盐水梯度稀释至一定数量级的浓度后，采用MRS琼脂培养基倾注平板培养，于42 ℃培养48 h后计菌落总数，测定乳酸菌活菌数。

保质期内霉菌及酵母总数的测定：按照GB 4789.15—2010《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》规定的方法检测。开菲尔酸乳饮料于4 ℃冷藏，将饮料用灭菌生理盐水梯度稀释至一定数量级的浓度后，采用孟加拉红琼脂培养基倾注平板培养，于（28±1）℃培养5 d后计霉菌和酵母菌落总数，并在观察期内记录霉菌及酵母菌数。

感官评定：开菲尔酸乳饮料由20名专业人员进行品尝，作出综合感官评价，并观察产品的颜色、状态、气味，感官评分标准见表1（满分100分）。

表1 开菲尔活菌型酸乳饮料感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of lactic acid bacteria beverage with kefir

2 结果与分析

2.1 开菲尔酸乳饮料配方、工艺单因素试验

本试验以产品口感和稳定性为最终评判标准，选择对影响开菲尔酸乳饮料品质较为主要的4个因素：羧甲基纤维素钠、果胶、蔗糖、发酵温度作为研究对象，开菲尔发酵剂Kefir M添加量为0.2 U/kg的条件下进行单因素试验，优化产品工艺、配方。

2.1.1 发酵温度对酸乳饮料感官评分的影响

将发酵剂按照无菌操作，接种到灭菌、冷却后的牛乳中，在蔗糖添加量7%，CMC添加量0.20%，果胶添加量0.15%的条件下，采用不同的发酵温度，发酵12 h，研究不同发酵温度下制作的发酵乳基料对酸乳饮料成品品质的影响，结果见表2。

表2 发酵温度对开菲尔酸乳饮料品质的影响Table 2 Effect of fermentation temperature on the quality of the lactic acid bacteria beverage with kefir

由表2可知，发酵温度较低时，发酵乳酸度较低，在调酸工艺中，需要添加较多的柠檬酸来调整酸乳饮料的终点酸度，导致酸乳饮料口感较为酸涩；发酵温度较高时，发酵乳产酸太快，形成较多蛋白凝结颗粒与乳清，发酵乳质构较差，会降低酸乳饮料的稳定性。较为适宜的发酵温度为25～31 ℃。

2.1.2 蔗糖添加量对酸乳饮料感官评分的影响

在发酵温度为28 ℃，CMC添加量0.20%，果胶添加量0.15%时，选择不同的蔗糖添加量，探讨蔗糖添加量对开菲尔酸乳饮料品质的影响，结果见表3。

表3 蔗糖的添加量对开菲尔酸乳饮料品质的影响Table 3 Effect of sugar on the quality of the lactic acid bacteria beverage with kefir

由表3可知，蔗糖添加量太少，酸奶口感偏酸，凝乳状态较软，且乳清析出较多。蔗糖量添加太多，口感偏甜。蔗糖添加量为6%～8%较适宜。

2.1.3 羧甲基纤维素钠添加量的确定

在发酵温度为28 ℃，蔗糖添加量为7%，高甲基果胶添加量为0.15%的条件下，选择不同的羧甲基纤维素钠的添加量，探讨其对开菲尔酸乳饮料品质的影响，结果见表4。

表4 羧甲基纤维素钠添加量对开菲尔酸乳饮料品质的影响Table 4 Effect of CMC on the quality of the lactic acid bacteria beverage with kefir

由表4可知，羧甲基纤维素钠添加量太高，产品黏度较高，口感不清爽，添加量太低，会出现乳清析出。羧甲基纤维素钠添加量为0.15%～0.25%时，产品状态及口感较好。

2.1.4 高甲氧基果胶添加量的确定

表5 高甲氧基果胶添加量对开菲尔酸乳饮料品质的影响Table 5 Effect of high methoxyl pectin on the quality of the lactic acid bacteria beverage with kefir

在发酵温度为28 ℃，蔗糖添加量为7%，羧甲基纤维素钠添加量为0.20%的条件下，选择不同的高甲氧基果胶的添加量，探讨其对开菲尔酸乳饮料品质的影响，结果见表5。

由表5可知，高甲氧基果胶添加量为0.05%～0.10%时，产品稳定性较差，较多蛋白沉淀与乳清析出；添加量增加，产品状态较为稳定，但口感和稳定性差异不明显。从产品成本和稳定性综合考虑，高甲氧基果胶添加量为0.1%～0.2%时，产品稳定性及口感较好。

2.2 开菲尔酸乳饮料配方、工艺的优选试验

以单因素试验结果为基础，将CMC、果胶、蔗糖、发酵温度的其添加量及组合采用L9（34）正交试验，确定产品的最佳工艺及配方，正交试验因素水平见表6，试验结果见表7，方差分析见表8。

表6 开菲尔酸乳饮料工艺配方优化正交试验因素与水平Table 6 Factors and levels of orthogonal experiment for beverage formula and process optimization

表7 开菲尔酸乳饮料工艺配方优化正交试验结果与分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiment for beverage formula and process optimization

从表6可知，A、B、C、D四个因素对产品品质的影响作用分别是B＞A＞C＞D，不同的稳定剂种类、蔗糖添加量及发酵温度的组合对产品的品质有很大的影响。CMC对菲尔酸乳饮料的品质影响最大，其次是发酵温度、果胶和蔗糖的添加量，配方最优组合为A2B2C3D3，即发酵温度28 ℃，CMC 0.20%，果胶0.20%，蔗糖8%，在此试验条件下进行感官验证，产品感官评分为92分。

表8 正交试验方差分析Table 8 Variance analysis of the orthogonal experiment

为进一步判断发酵温度、CMC、果胶、白砂糖4个因素对正交试验结果的影响，将数据进行方差分析。从表8可以看出，试验结果的方差分析与正交试验的结果是一致的，CMC的添加量对凝固型绿豆酸奶的感官评价有显著影响，其他因素影响不显著。

2.3 产品质量标准

感官指标：色泽呈乳白色，组织状态均匀，有微量乳清析出，无肉眼可见杂质。口味清爽、有少量气泡，质构细腻，甜酸适宜，具有独特的开菲尔发酵风味，无异味。

理化指标：pH值4.06，酸度52 °T，蛋白质1.07%，脂肪2.13%，总固形物含量12.35%。

微生物指标：乳酸菌活菌数4.03×109个/mL，细菌总数＜100 个/mL，大肠菌群＜3 MPN/100 mL，霉菌、酵母菌、致病菌未检出。

3 结论

通过产品配方正交试验和感官评价，确定开菲尔酸乳饮料中CMC的添加量为0.20%，高甲氧基果胶的添加量为0.20%，蔗糖添加量为8%，发酵温度为28 ℃制作成的开菲尔酸乳饮料酸甜适中，口感清爽，在保质期内状态稳定，无蛋白沉淀及乳清析出现象。

[1]毛 健，王 豪，苏米亚，等.开菲尔中生物活性物质的益生作用[J].中国乳品工业，2010，38（12）：30-35.

[2]刘 慧，李平兰，张永春，等.开菲尔的生理功能、特性及其产品开发研究进展[J].食品科学，2005，26（4）：252-254.

[3]CARROTE G L,ABRAHAM A G,DE ANTONI G L.Chemical and microbiological characterisation of kefir grains[J].J Dairy Res,2001,68(4):639-652.

[4]顾瑞霞，谢继志.乳酸菌与人体保健[M].北京：科学出版社，1995.

[5]郭本恒.酸奶[M].北京：化学工业出版社，2003.

[6]刘 丽，蔡云升.调配型酸乳饮料稳定剂及其稳定性的研究[J].食品工业科技，2005（5）：63-64.

[7]骆承庠.乳与乳制品工艺学[M].北京：中国农业出版社，1999.

[8]王 晴，王 宇，韩建荣，等.开菲尔发酵乳发酵参数变化趋势[J].食品与发酵工业，2009，35（11）：189-191.

[9]王丽杰，李 岩，王洪洋，等.绿豆茶乳酸发酵饮料的研究[J].中国酿造，2010，29（12）：167-169.

[10]潘道东，徐德闯.Lactobacillus helveticusJMC 1004 发酵乳抗高血压特性研究[J].营养学报，2005（3）：101-103.

[11]GUZEL-SEYD M Z B,SEYDM A C.Comparison of amino acidprofiles of milk,yogurt and kefir grain[J].Milchwissenschaft,2003,58(3/4):158-160.

[12]SCHOEVERS A,BRITZ T J.Influence of different culturing conditions on kefir grain increase[J].Int J Dairy Technol,2003,56(3):183-187.

[13]DOBSON A,O'SULLIVAN O,COTTER P D,et al.High-throughput sequence-based analysis of the bacterial composition of kefir and an associated kefir grain[J].FEMS Microbiol Lett,2011,320(1):56-62.

[14]孙明日，赵 军，赵山林.酸性乳饮料稳定性的研究[J].中国乳品工业，1999，27（1）：19-21.

[15]张 燕.果胶在发酵型酸性乳饮料钟的应用[J].食品与发酵工业，2002，28（12）：45-47.