海风藤提取物对胶原诱导性关节炎大鼠的影响

秦 晴 阙金花 张玉琴 李 煌 徐 伟 褚克丹

福建中医药大学药学院,福建 福州 350122

海风藤提取物对胶原诱导性关节炎大鼠的影响

秦 晴 阙金花 张玉琴 李 煌 徐 伟 褚克丹*

福建中医药大学药学院,福建 福州 350122

目的:研究海风藤正丁醇提取物对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织中NF-κB、IκB和IκK的影响，探讨其治疗作用机制。方法:通过建立胶原诱导性关节炎(CIA) 大鼠模型，观察大鼠足趾肿胀度的变化，蛋白印迹法检测大鼠踝关节滑膜组织中NF-κB、IκB和IκK的表达水平。结果:海风藤正丁醇提取物能改善大鼠活动减少、精神不佳等一般状态，下调滑膜组织中 NF-κB、IκK的表达及上调滑膜组织中IκB的表达。结论:海风藤正丁醇提取物对类风湿性关节炎有一定的治疗作用，其机理与调节滑膜组织中NF-κB、IκB和IκK的表达水平有关。

海风藤；胶原诱导性关节炎；NF-κB；IκB；IκK

海风藤是胡椒科植物风藤(Piperkadsura(Choisy) Owchi.)的干燥藤茎，辛、苦，微温，具有祛风湿、通经络、止痹通等功效[1]。目前，已有研究者初步发现海风藤正丁醇部位具有一定的抗炎作用[2]。本实验通过建立CIA模型，观察海风藤正丁醇提取物对胶原诱导性关节炎大鼠足趾肿胀度的变化及滑膜组织中NF-κB、IκB和IκK的含量的影响，在一定程度上探讨其防治RA的作用机制，为临床应用提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠，6周龄，体重200±20g，雄性，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物合格证号：SCXX(沪)2008-0005。福建中医药大学实验动物中心提供SPF级医学实验动物环境设施,使用许可证号:SYXK(闽)2009-0001。

1.2 药品与试剂 海风藤购自福州回春中药饮片厂有限公司，批号130928；雷公藤多苷片(黄石飞云制药有限公司，批号：20110501)；完全弗氏佐剂(CFA，美国Sigma公司，批号：F-5503)；牛Ⅱ型胶原(美国Sigma公司，批号：C-20022)；NF-κB、IκB和IκK一抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；二抗及相应试剂(厦门鹭隆生物有限公司)。

1.3 仪器 SE202F电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；YLS-7B足趾容积测量仪(济南益延科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 药物的制备 取海风藤7kg，用70 %乙醇回流提取3次，每次1.5h，合并提取液，回收乙醇，得到乙醇提取物。旋转蒸发回收乙醇，浸膏加水混悬后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，回收溶剂后蒸干得到正丁醇部位 377.37g。灌胃前正丁醇部位用0.5% CMC-Na混悬。

2.2 CIA大鼠模型的建立与给药方法 将50只Wistar大鼠随机分为5组：正常组、模型组、阳性对照组(雷公藤多苷片)、正丁醇低剂量组、正丁醇高剂量组，每组为各10只，根据文献方法进行造模[3-4]。即将完全弗氏佐剂(CFA)与2mg/ml 的牛Ⅱ型胶原乳液等体积混合，制成胶原乳剂，除正常组外，每只大鼠尾根部皮内注射胶原蛋白0.2mg。于第7 天进行第2次免疫，除正常组外，每只大鼠尾根部皮内注射胶原乳剂0.1mg(不完全弗氏佐剂(IFA)与2mg/ml的牛Ⅱ型胶原乳液等体积混合，制成胶原乳剂)。初次免疫后第1天开始分组给药，每日灌胃给药1次。正常组、模型组每日给予9.0g/L氯化钠注射液10ml/kg；高剂量组灌胃给予30.88mg/kg，低剂量组每日灌胃给予7.72mg/kg，雷公藤多苷组给予6mg/(kg·d)。连续给药28d。

2.3 蛋白印迹法测定NF-κB、IκB和IκK的表达 根据文献方法[5]，提取大鼠双后膝关节滑膜组织蛋白，4℃离心5min，取上清，分装，保存于-20℃冰箱，待用。取适量样品，加入等体积5×蛋白上样缓冲液，100℃金属浴10min。各组取20μg进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将分离蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶室温封闭2h，分别加入5 %脱脂奶配制的一抗[β-actin(1∶1000)、NF-κB(1∶1000)、IκB (1∶1000)、IκK (1∶1000)]，4℃过夜。TBST洗3×10min，加入5%脱脂奶配制的二抗(1∶7000)室温孵育2h，TBST洗3×10min，ECL发光显影。读取灰度值，比较每组NF-κB、IKB和IκK灰度值/β-actin灰度值的平均值。

3 结果

3.1 对CIA模型大鼠一般症状的影响 模型组大鼠于造模后第10天表现为足趾和踝关节开始出现肿胀，并日渐加重，食欲下降，体重减轻，活动减少，精神不佳，部分大鼠右后足出现足趾变形，无死亡情况；阳性对照组及给药组大鼠治疗后上述症状均有明显缓解。

3.2 鼠关节滑膜组织中NF-κB、IκB和IκK的蛋白表达 见图1和表1。

表1 大鼠关节滑膜组织中NF-κB、IκB和IκK的蛋白表达

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

模型组NF-κB和IκK阳性表达与正常组相比显著上升，而IκB阳性表达与正常组相比显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。海风藤正丁醇提取物低、高剂量组NF-κB、IκB和IκK阳性表达与模型组比较有明显的改善(P<0.05或P<0.01)，而且呈剂量依赖性。

4 讨论

Ⅱ型胶原蛋白混合弗氏佐剂的胶原诱导性关节炎模型与人类类风湿关节炎(RA)相似，既具有RA的急性病变，又有一定的慢性病变特征，是筛选和研究防止类风湿关节炎药物的理想模型[6]。本实验采用该模型，观察了海风藤正丁醇部位对模型大鼠关节和滑膜组织的影响，结果表明，海风藤对于改善CIA模型大鼠的一般病变情况包括精神状态、活动能力有一定的作用。

海风藤是胡椒科植物风藤的干燥藤茎，是一种常用的中草药。现代药理学研究发现，海风藤的乙酸乙酯部位、正丁醇部位、挥发油部位具有明显的抗炎活性[7]，为海风藤治疗抗风湿性关节炎奠定了物质基础。临床上，海风藤与其他药物配伍，大量用于治疗风湿、类风湿性关节炎的报道屡见不鲜[8-9]。然而，其抗风湿性关节炎的作用机理研究还不完善。本实验就运用大鼠CIA模型，初步探讨了海风藤正丁醇部位防治大鼠胶原性关节炎的作用机制。结果表明，海风藤正丁醇提取物能有效的调控大鼠膝关节滑膜组织中NF-κB、IκB和IκK的表达，说明其发挥抗炎作用可能是通过调节组织中NF-κB、IκB和IκK的等蛋白的表达。海风藤正丁醇提取物对CIA模型大鼠有明显的防治作用，其作用机制可能是通过调节NF-κB、IκB和IκK等蛋白的表达来发挥其抗炎抗风湿作用，从而减轻关节炎症状而达到治疗效果，值得深入探讨。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社,2010.

[2]袁林.海风藤抗炎活性成分研究[D].武汉：湖北中医学院，2008.

[3]Yuqin Zhang,Wei Xu,Huang Li,et al.Therapeutic effects of total Alkaloids of tripterygium wilfordⅡ Hook f.on Collagen-induced Arthritis in Rats[J].Journal of Ethnopharmacology，2013,145: 699-705.

[4]郑海音，徐伟，李煌，等.龙须藤抗类风湿关节炎有效部位的研究[J].浙江中医药大学学报，2013,37(3)：321-325.

[5]Xu W,Li H,Chu K,et al. Effects of shuangtengbitong tincture on collagen-induced arthritis in rats[J].MOLECULAR MEDICINE REPORTS，2013,8: 1479-1485.

[6]Ebina K,Oshima K,Matsuda M,et al.Adenovinrus-mediated gene transfer of adiponectin reduces the severity of collagen-induced arthritis in mice[J].Biochemical and Biophysical Resarch Communications,2009,378(2):186-191.

[7]李吉莹，刘艳菊，邴飞虹，等.海风藤抗炎作用的实验研究[J].湖北中医杂志，2006,28(12):17.

[8]章建华，成立，王维佳,等.五藤汤治疗类风湿性关节炎的临床研究[J].中国中医骨伤科杂志，2007,15(1):20-21，71.

[9]刘汉生，刘书明.参芪二藤汤治疗类风湿关节炎[J].山东中医杂志，2005,24(7):447.

Effects ofPiperiskadsuraecaulis extraction on rats with collagen-induced rheumatoid arthritis

QIN Qing,QUE Jin-hua,ZHANG Yu-qin,LI Huang,XU wei,CHU Ke-dan

College of Pharmacy,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China

Objective To investigate the therapeutic effect ofPiperiskadsuraecaulisextraction on collagen-induced rheumatoid arthritis rats, and its effects on NF-κB, IκB and IκK in synovial tissue, and to explore its therapeutic mechanism.Methods CIA rat model was induced by injecting bovine type II collagen.The swelling level of paw was observed and the expression of NF-κB, IKB and IκK were evaluated by Western blotting.Results The ethyl acetate extraces ofPiperiskadsuraecauliscould inhibit the paw swelling and down-regulate the expression of NF-κB,IκB and IκK.Conclusion The ethyl acetate extraces ofPiperiskadsuraecaulishave certain therapeutic on rheumatoid arthritis by reducing the expression of NF-κB, IκB and IκK in synovial tissue.

Piperiskadsuraecaulis;collagen-induced rheumatoid arthritis;NF-κB;IκB;IκK

国家自然科学基金资助课题(81001624)，校管课题(XB2011006)。

秦晴(1984-)，在职硕士研究生，研究方向:中药制剂及其质量标准,E-mail:13641655@qq.com。

褚克丹(1963-)，女，教授，博士生导师，研究方向:中药药剂及质量标准控制,E-mail:chukd5917@163.com。

R285.5

A

1007-8517(2015)07-0019-02

2015.01.23)