电灸心力衰竭大鼠内关—间使穴对心功能和内源性H2S的影响

崔白苹?丁凤云

摘 要：目的：研究电灸（electroacupuncture， EA）慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）大鼠内关-间使穴对CHF大鼠心功能和内源性H2S的影响。方法：SD大鼠随机分为假手术组、结扎左前降支冠状动脉致CHF组。CHF大鼠随机分为EA组和对照组。EA组每天电灸刺激内关-间使穴30min，EA对照组每天电灸刺激内关穴旁偏历-温溜穴（大肠经），超声心动图测定CHF大鼠心功能、心脏重塑和心肌梗死面积，取心脏和血酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）测定H2S含量。结果：与CHF大鼠和EA对照组相比，EA显著升高CHF大鼠左心室射血分数、逆转扩大的左心室收缩末期直径和舒张末期直径，降低梗死面积。EA组CHF大鼠心肌和血中H2S测定值显著高于对照EA组（心肌（10.13+3.35umol/L） vs （22.26+2.97umol/L）；血浆 （33.34+3.25umol/L） vs （51.13+2.55 umol/L） ， P < 0. 001），差异有显著性（ P 均< 0. 001）。结论：EA对CHF大鼠心肌有保护作用，能逆转心室重构，EA升高CHF大鼠心肌和血中H2S。EA可能是通过升高内源性H2S改善CHF大鼠心功能。EA可以作为一种治疗CHF的有效替代疗法。

关键词：电灸；心力衰竭；H2S ；内关-间使穴

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指由于心肌收缩力下降，使心输出量不能满足机体代谢的需要而引起的以循环功能障碍为主的综合征。随着人口老龄化进程的加快和高血压病、冠心病等常见心血管病发病率的上升，CHF患病率正逐渐升高。据世界卫生组织（WHO）预测，到2020年心血管疾病将成为世界上死亡率最高的疾病。心力衰竭是多种心血管疾病的最终结局，心室重构被认为是导致心力衰竭及其病情恶化的内在原因。中医理论中，针灸早在1000多年前就已经用来治疗多种疾病和不适，现在世界范围内已经广泛接受针灸作为一种替代疗法。临床证据和动物实验均表明针灸对高血压、心律失常和冠心病[1-4]都有治疗作用。内关属手厥阴心包经，间使属手厥阴心包经，位于正中神经上[5-6]。刺激内关-间使穴能显著降低心交感神经反射[1，4，7]。因此，本实验选内关-间使穴施行电灸。硫化氢（hydrogen sulfide， H2S）是继一氧化氮（nitric oxide， NO）和一氧化碳（carbonic oxide， CO）之后发现的第三类气体信号分子，具有多种生理功能。心脏病内源性H2S降低[8-11]；H2S可以抑制心肌重构[9，12-14]；H2S通过抗氧化、抗凋亡保护心肌细胞。电灸CHF大鼠内关-间使穴对CHF大鼠心脏是否有保护作用，对内源性H2S是否有影响尚不清楚。

一、材料与方法

1.材料

（1）实验动物。雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，清洁级，体重300～400g，由南京医科大学实验动物中心提供。实验动物使用遵守美国国家卫生机构发布的《实验动物保护和使用指南》（NIH，Publication No.85-23，1996修订版）。大鼠随机分为两组，一组为慢性心力衰竭模型（CHF）组，另一组为假手术（Sham）组。实验大鼠在温度22 ℃、湿度30～40%的环境中饲养，12小时明暗周期，自由饮水和摄食。

（2）试剂与仪器。主要试剂：戊巴比妥钠（生工生物工程（上海）股份有限公司），H2S ELISA试剂盒（Rapidbio，West Hills，USA）。主要仪器：Vevo超高分辨率小动物超声影像系统（Vevo2100， 加拿大VisualSonics公司）；PowerLab数据分析处理系统（8SP，AD instruments，澳大利亚）；小动物呼吸机（Model 683，Harvard Apparatus Inc.，美国）；台式高速冷冻离心机（Sigma，1-15PK，德国）；HANS-200A韩氏穴位神经刺激仪（北京盛达医疗器械中心， 北京）。

2. 实验方法

（1）动物造模。本实验采用冠状动脉结扎诱发CHF方法。在戊巴比妥钠（50 mg/kg，i.p.）麻醉下，按照无菌操作进行手术。经口腔途径气管插管，与啮齿类动物呼吸机（Model 683，Harvard Apparatus Inc.，USA）相连进行机械通气。在无菌手术条件下于左侧第四肋间隙打开胸腔，剪开心包，暴露心脏。用6/0号缝合线在靠近主动脉根处结扎冠状动脉左前降支（left anterior descending coronary artery，LAD），引起心脏局部缺血。Sham组除了不结扎LAD外，其余操作均相同。大鼠死亡率约30%，死亡主要发生在结扎后第一天。EA实验在冠状动脉结扎或对照组假手术后4周末进行。用Vevo超高分辨率小动物超声影像系统（Vevo2100， 加拿大VisualSonics公司）评价心率、射血分数（ejection fraction，EF）、短轴缩短率（shortening fraction，FS）、左室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）和左室收缩末期内径（left ventricular end systolic diameter，LVESD） 指标确定CHF成模。

（2）电灸内关-间使穴。大鼠的穴位与人类似，内关-间使穴位于中神经上。不绣钢电针置于腕关节上1.5-2.0mm和2.5-3.0mm处掌长肌腱和屈腕桡侧的韧带中间的内关间使穴上。穴位准确的标准是电针刺激时大鼠前爪轻幅度震动。HANS-200A韩氏穴位神经刺激仪低电流、低频（2Hz，2mA）刺激30min。CHF大鼠EA对照组选择了靠近内关-间使穴的偏历-温溜穴（大肠经）。

（3） H2S 的ELISA检测。采取大鼠腹主动脉血2 ml， 3000 r/ min 离心10 min， 分离血浆， EP 管密封后- 70 ℃ 保存待检， 测定前将标本复融， 3000 r / min 离心10 min， 取上清液检测。心肌组织冰上充分碾磨匀浆，离心20min（3000r/min），收集上清- 70 ℃ 保存待检。应用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），按照大鼠ELISA试剂盒（ Rapidbio （RB）， West Hills， CA， USA）说明书中所述操作步骤分别检测血浆和心肌组织中H2S水平。简述如下：在酶标板上加样、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、加终止液、在酶标仪（ELX-800，BioTeK，Winooski，USA）上读取样本吸光度，绘制标准曲线，并根据标准曲线方程和标准品浓度，计算H2S水平。

（4）计算梗死面积。以常规的方式处理进行组织学研究，从顶点到底部把左心室切成四横片，5um厚，Masson染色。ImageJ 1.34软件是用来测量长度和左心室梗死面积。在每个心肌组织片，梗死率定义为梗死部位周长与整个心内膜的周长的比值。左心室切片的面积乘以梗死率就是该心肌切片的梗死面积。左心室的梗死率就是左心室的梗死面积与左心室总面积的比值 。

（5）统计处理方法。应用SPSS 17. 0 统计软件对数据进行分析。计量资料以均数+标准差（ x + SE） 表示， 两组间比较用t 检验， 多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法。计数资料组间比较用卡方检验。应用Pearson 法进行相关性分析。以P < 0.05 为差异有统计学意义。

二、 结果

1. 解剖学和血流动力学变化

CHF大鼠左心室梗死面积平均为左心室面积的34.5%，而Sham组大鼠没有明显的心肌梗死。与Sham大鼠相比，CHF大鼠心脏的重量与体重比值显著增加，这提示CHF大鼠心肌非梗死区发生肥大。CHF大鼠射血分数、左室短轴缩短率和+LV dP/dtmax降低，而LVESD和LVEDD增加，这提示CHF大鼠心脏射血功能降低，心室扩张重构（Table 1）。

三、讨论

心脏的收缩和舒张功能受损形成CHF。目前，CHF的主要病因是缺血性心脏病、高血压和心肌病。尽管心衰药物的疗效越来越好，世界范围内，CHF仍有较高的发病率和死亡率，据报道，男性患者5年存活率25%，女性患者5年存活率38%，因此，发现有效的治疗心衰的方法备受期待。针灸是被普遍接受的治疗干预手段，在美国针灸是广泛应用的替代疗法。针灸除了治疗术后疼痛，还可以有效地治疗术后和化疗引起的恶心和呕吐。针灸也可以作为一个有效的方法治疗其他情况，如上瘾、头痛、网球肘、肌筋膜疼痛、年骨关节炎、腰痛和哮喘。内关-间使穴是治疗心血管疾病最有效的穴位[23- 25]。在冠状动脉部分阻塞的猫身上，模拟EA内关穴刺激中神经能增加心脏供氧，减少局部心肌梗死面积。硫化氢（H2S）是人体内继一氧化碳（CO）、一氧化氮（NO）后的第3种气体信号分子，在中枢、心血管系统等发挥重要作用。先天性心脏病患儿和心力衰竭病人血浆H2S降低[27，28]，大量研究证明，H2S可抑制心力衰竭的发生，对心脏具有保护作用[29-31]。H2S可以改善心肌重构， 缺血诱发心衰的小鼠模型中，再灌注后连续给予7 天 H2S 供体Na2S 可有效抑制心衰导致的左心室舒张末期及收缩末期容积增加，并抑制左室射血分数、左室缩短率的降低，提高左心室功能，发挥心脏保护作用。但是， EA是否能增加内源性H2S，能否能改善心功能和心室重构尚不清楚。

我们实验证明，EA能改善心功能，降低心肌梗死面积，改善心肌重构；EA能升高CHF内源性H2S。EA升高CHF内源性H2S可能是改善心功能和重构的重要机制。EA能降低CHF大鼠的血压和心率，但是与对照-EA相比没有显著差异。有研究证明低频刺激人的内关-间使穴对血压和心率有双向调节作用。研究发现针灸可以通过降低交感神经的兴奋性，改善心功能，但其具体的分子机制尚不清楚。

针灸可以作为一种有效的治疗心衰的替代疗法，其大规模、长期的临床试验和其作用机制有待进一步开展实施。

参考文献：

[1].苏钰雯，丁亚光，张春雨，等. 先天性心脏病患儿血浆硫化氢变化的意义[J]. 实用儿科临床杂志，2005，07：632-634.

[2]刘国磊，刘青云，陈奎， 等. 内源性硫化氢在大鼠心力衰竭中的变化及作用[J]. 郧阳医学院学报，2008，01：16-18+103.

[3]苏钰雯，杜军保，韩薇， 等. 多柔比星致心力衰竭大鼠血浆及心肌组织内源性硫化氢变化的意义[J]. 实用儿科临床杂志，2006，19：1312-1313+1335.

[4]田云朋，王虹艳，曲鹏， 等. 老年缺血性心力衰竭患者血浆硫化氢水平变化[J]. 中华高血压杂.

基金资助：江苏高校优势学科建设工程资助项目（JX10231801）.