鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

涂玉蓉 李美娣 武 力*

（广州华农大实验兽药有限公司 广州 510642）

鸡大肠杆菌病是严重危害养鸡业的重要细菌性传染病，规模养鸡场细菌性疫病的发生以大肠杆菌为主。随着我国养鸡业的持续发展,特别是集约化程度的加深,鸡大肠杆菌病的流行日趋严重,由于区域性差异较大、防治措施和手段相对薄弱,造成我国鸡大肠杆菌病比国外更为复杂。该病血清型多样、抗原性复杂、临床症状和病理变化多变,不同品种、不同日龄的鸡群均可发病,轻者可以引起鸡群生产性能下降,重者导致发病鸡大批死亡,尤其对雏鸡危害更大。

该病在一些养殖场中仍严重发生，临床上经常使用大量的抗菌药物，导致不断出现耐药大肠杆菌株，从而也不断扩大了耐药谱[1-2]；同时还加剧了抗菌药物在畜禽体内的残留，不仅给养禽业的持续发展带来潜在危害，还严重影响到食品安全，从而危及人类的身体健康。本文在广东地区疑似患鸡大肠杆菌病的病料中分离到“大肠杆菌”，对其进行分离鉴定和药敏试验，在此基础上进行防治，并对广东地区鸡大肠杆菌病的综合防制措施进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

从疑似发生鸡大肠杆菌病的广东鸡场采集病料，临床剖检病死鸡，发现有典型心包炎、肝周炎、气囊炎或卵黄性腹膜炎等症状。

1.1.2 试剂

培养基：麦康凯培养基、LB 肉汤和营养琼脂培养基为广州环凯生物技术有限公司产品。

葡萄糖、甘露糖、缓慢发酵蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖和尿素酶等微量细菌生化管均为北京陆桥技术有限责任公司产品。

药敏纸片：头孢他啶（CAZ）、链霉素（STR）、环丙沙星（CIP）、阿莫西林(AMX)、四环素（TCY）、替米考星(TIL)和氟苯尼考(FFC)均为杭州天和生物制品科技有限公司产品。

其他化学试剂均为国产分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 病原的分离培养

将接种环在酒精灯上煅烧消毒，待接种环冷却后，采集病（死）鸡心、肝、脾、肺及卵黄液，无菌操作划线接种于麦康凯琼脂平板上，于37℃生化培养箱培养18～24h，观察结果；挑取疑似大肠杆菌的单个菌落进一步纯化培养。

1.2.2 形态学鉴定：染色镜检

将疑似菌株进行涂片和革兰氏染色程序染色，并观察显微镜下的细菌形态。

1.2.3 生化试验鉴定

选取在麦康凯琼脂上长出的砖红色菌落分别作V-P、三糖铁试验、各种糖发酵试验、吲哚试验、尿素酶试验和MR 试验。

1.2.4 致病性试验

将分离到的大肠杆菌接种于肉汤培养基37℃培养24h，按比浊计数法计数，配制成菌浓度为1×109cfu/mL 的菌液。给每组9 只雏鸡进行腹腔注射菌液0.2mL。对照组9 只注射灭菌肉汤0.2mL。攻毒后，观察雏鸡状态，记录精神、行为、健康和死亡情况及数据，并及时剖检死亡鸡，分离细菌。判定标准：能使试验鸡在24 h 内全部死亡或在48 h 内死亡2/3 以上的菌株作为致病菌株。

1.2.5 药物敏感性试验

按照国外常用的Kirby－Bauer 法（简称K-B 法）进行。在无菌的条件下，将鉴定为鸡大肠杆菌的纯培养物接种于LB 肉汤中，置于37℃温箱中培养24 h，稀释菌液至0.5 标准麦氏比浊管，用灭菌棉签蘸取稀释过的菌液并挤去多余的液体，在MHA 平板上均匀涂布，盖上平板，置室温数分钟至培养基的表面无明显液体，用无菌小镊子夹取药敏纸片平贴于琼脂平板表面，然后翻转倒置于37℃恒温箱培养24 h，测量抑菌环直径并判定结果。

本试验所选用的药敏纸片有：头孢他啶、链霉素、环丙沙星、阿莫西林、四环素、替米考星和氟苯尼考。把抑菌圈直径的大小作为敏感性的高低，采用WHO 质控标准菌的敏感性及抑菌圈大小划分方法报告结果，即敏感、中度敏感和耐药。药敏纸片种类及判定标准见表1。

2 结果

2.1 细菌分离培养结果

在麦康凯琼脂上形成红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐、直径为1.5～2.5mm 的小菌落。

2.2 染色镜检结果

涂片并染色后显微镜下可见大多数分散排列，偶尔有2～3 个连在一起，两端钝圆，两端浓染的革兰氏阴性短杆菌。

2.3 生化试验结果

分离获得的4 株疑似大肠杆菌生化试验结果显示:均能发酵葡萄糖、甘露糖，缓慢发酵蔗糖果糖、乳糖、麦芽糖,产酸、产气或是不产气。MR 试验阳性，三糖铁底层产酸，V-P 试验阴性，尿素酶试验阴性，产生靛基质，详见表2，其结果符合大肠杆菌的生化特性。

2.4 致病性试验结果

大部分雏鸡6h 以后开始出现症状，表现精神沉郁，食欲下降，多数出现腹泻，有的出现神经症状。接种12 h 后开始出现死亡。剖检死亡鸡，表现为典型大肠杆菌病病变，并且从死亡鸡病变组织均能回收到相应接种致病菌株。

2.5 药敏试验结果

试验结果显示，分离菌株对头孢拉定、环丙沙星、替米考星和氟苯尼考等药物敏感，对链霉素、阿莫西林和四环素耐药，详见表3。

3 讨论

本试验从广东地区疑似患鸡大肠杆菌病的病料中分离到疑似细菌，进行了细菌形态观察、培养特性和生化特性鉴定，证实为大肠杆菌，且分离的大多数菌株为致病性大肠杆菌。药物敏感试验结果表明，分离菌株对头孢拉定、环丙沙星、替米考星和氟苯尼考等药物敏感,对链霉素、阿莫西林和四环素耐药。试验证明药敏试验结果与临床治疗应用效果不尽相同,药敏试验可作为临床治疗大肠杆菌病选药的重要依据,但不能据此不加选择地盲目投药。在生产当中用药不规范、疗程不当或是长期使用同一类药物或长期在饲料、饮水中加入预防性用药，均可促使细菌产生抗药性[4-5]。本文鸡大肠杆菌的分离和鉴定为广东地区大肠杆菌的流行病学打下了基础，对分离菌株进行的耐药性试验为临床治疗提供了依据，为广东地区鸡大肠杆菌病的防治积累了经验，并具有一定的指导意义。

表1 药敏纸片种类及判定标准（mm）

表2 生化反应结果

表3 药敏试验结果（mm）

另外，尚应当注意，即使经药敏试验筛选出了一些敏感药物用于临床鸡大肠杆菌的防控，表面上效果并不见得理想，此时，一要考虑是否混合感染鸡沙门氏菌等其他病原[6-7]，二要注意药物体外与体内作用环境不同等问题，在实际用药选择上应作科学、全面的考虑。

[1] 张晓红. 鸡大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验[J]. 中国动物检疫,2013,30(1):65-66.

[2] 张遂平,杨建奋,邵艳华.鸡大肠杆菌分离及药敏试验研究[J].中国畜牧业,2013(2):62-63.

[3] 邹玲,任慧英.鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医,2007,34(2):119-121.

[4] 刘桂荣. 鸡大肠杆菌病的流行状况与防治[J].家禽科学,2007(6):28-29.

[5] 刘娣琴,杨红梅,贾志江.鸡大肠杆菌病的防制误区与对策[J].畜牧兽医杂志,2012,31(5):89-89.

[6] 雷崇良.鸡沙门菌、大肠杆菌和传支混合感染的诊治[J].中国家禽,2004,26(6):24.

[7] Cabrera R,Ruiz J,Marco F, et al.Mechanism of resisitance to several antimicrobial agents in Salmonella clinnical isolates causing traveler’s diarrhea [J].Antimicrob Agents Chemothe,2004,48(10):3934-3939.