胰高血糖素样肽-1对高糖诱导的兔胸主动脉内皮细胞凋亡与增殖的影响*

蔡方刚，郭平凡，詹腾辉，吴捷

（福建医科大学附属第一医院 血管外科，福建 福州350004）

糖尿病周围血管病变是糖尿病的一种较为严重的并发症，与其体内的高糖等代谢紊乱有关，高糖等引起的血管内皮细胞损伤是糖尿病血管病变的基础[1]。胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）可应用于糖尿病的治疗，近年来，其对心血管疾病的作用也越来越受到人们的重视，本研究通过观察其对兔胸主动脉内皮细胞在高糖下增殖与凋亡变化的影响，来观察其对糖尿病血管病变的可能作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

新西兰大白兔，雄性，体重约2.5～3.0 kg，购于吴氏实验动物中心，GLP-1、GLP-1受体拮抗剂（exendin9-39）、Ⅰ型胶原酶、四甲基偶氮唑盐（MTT）（Sigma公司），BRDU增殖试剂盒、TUNEL凋亡试剂盒（Roche公司），M199细胞培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.25%胰酶-EDTA（Life公司），其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 兔胸主动脉内皮细胞培养

无菌条件下取兔胸主动脉约5 cm，PBS冲洗2、3次；向血管内注入约1～2ml 0.1% I型胶原酶，37℃15～20min，用M199培养液冲洗3、4次，300 g离心10min；弃上清，加入含20%FBS的M199培养基，置37℃5%二氧化碳CO2培养箱24 h，更换培养基；镜下观察，待细胞长至70%～80%汇合时行1∶2传代，取3～5代细胞进行实验。实验分为4组，分别为对照组（正常糖浓度）、高糖组（33mM）、GLP-1组（GLP-1+高糖）、exendin9-39组（GLP-1+exendin9-39+高糖）。其中，GLP-1组为GLP-1（10-8M）预处理内皮细胞60min后，再给予高糖（33mM）干预24 h。exendin9-39组为exendin9-39（10-7M）预处理30 min后加GLP-1（10-8M）60min再给予高糖（33mM）干预24 h。各组进行各项指标的检测。

1.3 TUNEL法测定胸主动脉内皮细胞凋亡

取3～5代兔胸主动脉内皮细胞消化接种于预先放置有盖玻片6孔培养板中，105细胞/孔，观察待细胞生长至约60%～70%汇合时更换0.2% FBS的M199培养基24 h，加入33mM葡萄糖及其他试剂干预，继续培养24 h，弃培养基，PBS洗涤1次，4%甲醛固定液15min，弃固定液，PBS漂洗5min×3，加0.1%Triton于25℃条件10min，加5μg/ml蛋白酶K37℃20min，PBS漂洗5min×3，加TUNEL反应液50μl/片，37℃60min，PBS漂洗5min×3，加converter-POD混合液50μl/片，37℃ 30 min，DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。

1.4 BRDU法测定胸主动脉内皮细胞增殖

取3～5代兔胸主动脉内皮细胞消化接种96孔培养板，2×103细胞/孔，观察待细胞生长至约60%～70%汇合时更换0.2%FBS的M199培养基24 h，加入33mM葡萄糖及其他试剂干预，继续培养24 h，弃培养基，PBS洗涤1次，4%甲醛固定液15 min，弃固定液，PBS漂洗5 min×3，加HRP-Anti-BRDU抗体（1∶100）于25℃条件2 h，PBS漂洗5m in×3，加BRDU试剂盒中D反应液100μl/孔，37℃10～20 min，加25μl/孔1M H2SO4终止，酶标仪450 nm检测，以OD值大小表示细胞增殖水平。

1.5 MTT法测定胸主动脉内皮细胞代谢与增殖活性

取3～5代兔胸主动脉内皮细胞消化接种96孔培养板，2×103细胞/孔，观察待细胞生长至约60%～70%汇合时更换0.2% FBS的M199培养基24 h，加入33mM葡萄糖及其他试剂干预，继续培养24 h，加10×MTT 10μl，37℃继续培养4 h，弃培养液，加100μl DMSO，小心振荡1～2min，酶标仪450 nm波长检测，以OD值大小表示细胞代谢增殖活性水平。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 GLP-1对高糖诱导内皮细胞凋亡的影响

对照组兔内皮细胞形态规则，多呈卵圆状，只见少量细胞核呈棕黄色；高糖组内皮细胞形态呈多形性，并有大量内皮细胞细胞核呈棕黄色；GLP-1组呈星形，卵圆状只见少量棕黄色细胞细胞核；exendin9-39组内皮细胞形态多呈卵圆，可见大量量细胞核有棕黄色颗粒（见图1D）。每张切片在高倍视野下（×200）取5个视野，计数5个视野中每100个细胞中染色阳性的细胞数（%），取其平均数作为各组凋亡率。与对照组相比，高糖组细胞凋亡明显增加（P<0.01）；与高糖组相比，GLP-1组可显著降低高糖诱导细胞凋亡（P<0.05），而exendin9-39组细胞凋亡率与高糖组差异无统计学意义。见图1。

图1 各组兔胸主动脉内皮细胞凋亡的变化

2.2 BRDU法测GLP-1对高糖下内皮细胞增殖的影响

高糖明显地抑制内皮细胞增殖活性，与对照组相比，高糖组内皮细胞增殖水平显著降低（P<0.01）。与高糖组相比，GLP-1组内皮细胞增殖水平显著升高；exendin9-39组内皮细胞增殖水平与高糖组相比无明显差别（P>0.05）。见图2。

2.3 MTT法检测GLP-1对高糖诱导内皮细胞代谢的影响

高糖抑制内皮细胞代谢活性，与对照组相比，高糖组内皮细胞代谢水平显著降低（P<0.01）。与高糖组相比，GLP-1组内皮细胞代谢活性显著升高（P<0.05），而exendin9-39组内皮细胞代谢活性与高糖组相比无明显差别（P>0.05）。见图3。

图2 各组内皮细胞增殖的变化

图3 各组MTT值的变化

3 讨论

糖尿病所引起的高血糖、脂代谢紊乱、胰岛素拮抗等因素引起的内皮细胞损伤是糖尿病血管病变的始动环节。研究表明持续性的高血糖可引起内皮细胞缺失、血管收缩、局部组织缺血缺氧、血管平滑肌细胞增生，从而导致糖尿病血管病变的发生[2]。从本实验可以看出，高糖可以导致血管内皮细胞的凋亡增多，而增殖减少，细胞的活性下降。高糖引起的内皮细胞损伤与其引起胞内的氧自由基产物生成增多密切相关[3]。

GLP-1是一种肠道分泌的肽类激素，有促进胰岛素合成与分泌，以及增加β 细胞的增殖分化与抑制其凋亡的作用，在维持机体糖代谢稳态中发挥重要作用。近年来，许多研究发现，它对心血管也有保护作用。HALBIRK等[4]发现，GLP-1可以改善心力衰竭动物及急性心肌梗死患者的射血分数和左心室功能。它具有提高心肌正性肌力，促进心肌摄取葡萄糖，抑制心肌细胞凋亡，降低缺血/再灌注损伤的作用。而ERDOGDU等[5]发现，GLP-1类似物可以促进心脏的冠状动脉的内皮细胞增殖。但它对糖尿病外周血管的病变是否有保护作用，尚未有进一步的研究。本研究通过分离兔胸主动脉的内皮细胞进行原代培养发现，GLP-1可以明显地减少高糖引起的血管内皮细胞凋亡，并改善高糖对血管内皮细胞增殖的抑制作用，而加入GLP-1的受体拮抗剂，此作用明显减轻。这说明GLP-1对高糖引起的血管内皮细胞损伤具有保护作用，而这作用是由其受体介导的。

GLP-1具体的作用机制还不甚明了。虽然GLP-1受体是一种G蛋白耦联受体，在体内包括心脏、血管、神经等组织均有存在。但现阶段的研究认为，GLP-1的作用有依赖与不依赖GLP-1受体途径两种方式，GLP-1促进血管内皮依赖性扩张与其经非受体方式有关[6]。一些离体的细胞培养实验表明，单纯的GLP-1受体激动剂对血管内皮细胞的缺血再灌注损伤等并没有保护作用，存在着另一种非受体介导方式[7]。但GLP-1通过其受体介导，抑制PKC-α 和NADPH 等信号转导通路，减少了TNF-α 引起的内皮细胞损伤[8]。本实验表明GLP-1对高糖引起的血管内皮细胞损伤的保护作用与其受体介导有关。当GLP-1与内皮细胞表面的GLP-1受体结合后，影响了细胞内的PKA和PI3K/Akt等信号传导通路，可导致细胞的增殖与凋亡发生变化[9-10]。

本实验只是作为研究GLP-1对糖尿病血管病变作用的基础，具体的GLP-1作用机制，包括GLP-1受体在此间的作用方式等还有待进一步的研究阐明。

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