中药对猪源大肠杆菌O8体外抑菌试验研究1*

张赛奇，王 米，雷 娜，杨锐乐， 薛飞群

(中国农业科学院 上海兽医研究所/中国农业科学院兽药安全评价与兽药残留研究重点开放实验室/农业部动物寄生虫学病重点实验室,上海 200241)



中药对猪源大肠杆菌O8体外抑菌试验研究1*

张赛奇，王 米*，雷 娜，杨锐乐， 薛飞群*

(中国农业科学院 上海兽医研究所/中国农业科学院兽药安全评价与兽药残留研究重点开放实验室/农业部动物寄生虫学病重点实验室,上海 200241)

为了探讨猪源大肠杆菌O8对黄连等10种中药的体外敏感性，采用琼脂扩散法和微量二倍稀释法对10种中药水提物进行体外抑菌试验，测定抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC)。结果表明：黄连对大肠杆菌O8呈高度敏感，抑菌圈直径为21.3 mm，其MIC值为7.813 mg/mL，抑菌效果最好；黄芩、五倍子呈中度敏感，其MIC值为31.25 mg/mL；而苦参不敏感，其MIC值为500 mg/mL，抑菌效果差。

中药；猪源大肠杆菌O8； 体外抑菌试验；最小抑菌浓度

大肠杆菌是造成新生仔猪和断奶仔猪腹泻的最重要病原，其中产肠毒素大肠杆菌( ETEC) 是最主要的致病菌，病原以O8、O101等大肠杆菌较为常见，对养猪业的危害极大[1]。大肠杆菌的血清型比较多，引起的疾病目前无理想的疫苗来预防，临床多采用抗菌药物进行治疗，但由于抗菌药物持续地和不恰当地使用，导致大肠杆菌耐药机制不断变迁，耐药性不断提高，同时这些药物大量使用造成畜产品中药物残留严重，从而威胁人类健康。如何选用对大肠杆菌有较好抑制作用的药物是当今兽医临床的主要任务之一。

中兽医理论认为，中药具有提高机体免疫力、抗菌、中和降解毒素和促进肠黏膜愈合等作用。同时，中药主要通过调整机体功能状态来实现抗菌作用，而西药侧重于药物与微生物间的作用[2]。中药的这种独特优势为人们提供了新的研究内容。虽然目前市场上有很多纯中药兽药产品，但对其基础研究仍比较薄弱。近年来，有关中药对病原菌的体外抑菌效果陆续有报道，但一般只对中药的抑菌属性进行定性分析。本研究旨在对10种单味中药对猪源大肠杆菌O8的体外抑菌活性进行定性和定量研究，以便为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

中药黄柏、苦参、生大黄、连翘、白头翁、五倍子、秦皮、金银花、黄连、黄芩均购于上海安德大药房，所有药物经鉴定均符合生药质量标准。猪源致病性大肠杆菌O8，型号C83901，购于中国兽医药品监察所微生物贮藏中心。培养基：①普通肉汤培养基: 牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，纯化水至1 000 mL， pH 7.2～7.4; ②普通营养琼脂培养基: 蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，纯化水至1 000 mL，pH 7.2～7.4。配制后高压灭菌后置于4 ℃冰箱中保存备用。

主要仪器：R 系列旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司生产;ESCO生物安全柜，新加坡Esco 科技有限公司生产；96微孔板，丹麦Nune 公司产品；微量移液器，德国Eppendorf公司生产；高速离心机，ThermoFisher Scientific公司生产。

1.2 菌液培养

试验前将菌种接种到肉汤培养基复活备用。将复活的供试菌接种于普通琼脂培养基上，置于37 ℃恒温箱中培养24 h，待菌种复壮后使用。挑取典型菌落接种于新鲜肉汤培养基中，37 ℃培养16～18 h， 连续培养 3代，以恢复其活力。用灭菌生理盐水稀释培养液，按照麦氏比浊法使其浊度达1×105～1×109CFU/mL，备用。

1.3 药物制备

10味中药分别加适量的水浸润后，加10倍量的水加热煮沸，煮沸后改文火煮1 h，前后共煮两次。合并两次药液，过滤，离心沉淀、最后浓缩至含量为1 mL相当于原生药1 g。分装，调整pH至7.3，流通蒸气灭菌20 min，4 ℃保存。

1.4 试验方法

1.4.1 琼脂扩散法 参考文献[3]将之前培养至对数期的菌悬液稀释成107cfu/mL，分别取1 mL于培养皿内，再加入20 mL冷却至45 ℃左右的营养琼脂培养基混匀，完全冷却后用直径6 mm的打孔器均匀打孔，每板4孔，去除孔内琼脂并适当封闭孔底。每孔加入100 μL中药提取液，以满而不溢为宜并做好标记。置4 ℃冰箱中作用1 h后取出，于37 ℃条件下培养24 h，用游标卡尺测量各抑菌圈直径，判断各种药液对大肠杆菌的抑菌效果。无菌水作为对照，每个处理设3次重复。结果判定标准： 抑菌圈直径>20 mm为高敏,抑菌圈直径15～20 mm为中敏,抑菌圈直径10～15 mm为低敏，抑菌圈直径<10 mm为不敏感。

1.4.2 微量2倍稀释法(MIC试验) 参考文献[4]将各中药提取液用2倍法配成系列浓度的供试药液，分别加入96孔板的第2孔至第11孔，每孔100 μL，再将之前培养至对数期的菌悬液稀释成107cfu/mL，每孔加入100 μL，至此96孔板每孔体积为200 μL(为避免培养过程中水分蒸发不均造成的影响，第1孔和第12孔不加药，仅加入200 μL无菌水)，37 ℃条件下培养24 h，每孔再加入40 mL浓度为0.2 mg/μL的碘硝基四唑紫指示剂，继续培养30 min后取出观察每孔细菌生长情况，其中浑浊并带有粉色沉淀的说明有细菌生长，澄清透明的则说明在该孔相应的药物浓度下对细菌生长代谢有抑制作用，最小抑菌浓度值(MIC值)即能抑制细菌生长的最低药物浓度。无菌水作为对照，每个处理设3次重复。

2 结果与分析

2.1 供试中药敏感性测定结果

从表1知，各中药对大肠杆菌的敏感性不同，其中黄连对猪源大肠杆菌O8的敏感性最强，其抑菌圈直径为21.3 mm；黄芩、黄柏和五倍子为中度敏感，其抑菌圈直径分别为17.0 mm、16.7 mm和17.3 mm；连翘、金银花、大黄、白头翁和秦皮对大肠杆菌具有较低的敏感性，抑菌圈直径分别为10.3 mm、13.3 mm、14.7 mm、12.1 mm和14.6 mm；而苦参则对大肠杆菌没有敏感性，没有呈现明显的抑菌圈。

表1 不同中药的体外抑菌效果

注：抑菌圈直径为3次平均值，抑菌圈大小包括孔径(6 mm);“-”表示未检出。

Notes: The inhibitory zone diameter was the average values of 3 tests, and the size of inhibitory zone included the bore diameter(6 mm) ；“-” means the inhibitory zone could not be obtained.

2.2 MIC的测定结果

从表2可以看出，各中药对大肠杆菌均具有一定的抑菌效果，各中药的MIC 值有一定的差异，其中黄连、黄芩和五倍子的抑菌效果较强，其MIC值分别为7.82、15.63和15.63 mg/mL，明显高于其他中药；其次为黄柏、大黄、金银花、秦皮等，这些中药对大肠杆菌的MIC值没有超过125 mg/mL，也表现出较好的抑菌效果；依次为白头翁、连翘，这两味中药也呈现出一定的抑菌效果；而苦参的抑菌效果较差，MIC值已超过250 mg/mL。

表2 各中药最低抑菌浓度(MIC)试验结果

注：“-”表示无细菌生长；“+”表示有细菌生长，随着“+”数增加菌落长势增强。

Notes:“-” means no bacterial growth;“+” means bacterial growth, and with the increase of “+” the colonies grow better.

3 讨 论

研究中药对病原菌的体外抑菌活性试验方法很多,一般采用的方法有管碟法、固体培养基法、纸片抑菌法、平皿稀释法以及琼脂扩散法等，它们通常只用于对中药的抑菌活性作定性研究，定量分析常用二倍稀释法[5]。本试验中，笔者采用琼脂扩散法和二倍稀释法两种方法，同时对传统方法进行了稍加改进。结果表明，这2种方法具有一定的相关性，同时也存在一定的差异性。

本次试验所取中药分为清热药、解表药、攻下药和收涩药等[6]。10种中草药体外抑菌试验表明，在中药浓度为1 g/mL时，黄连对猪大肠杆菌呈高度敏感，最小抑菌浓度为7.82 mg/mL，表现出很好的抑菌效果，这与李福娟[7]报道的相一致；其次为黄柏、大黄、金银花等，其对猪大肠杆菌呈中度敏感，最小抑菌浓度没有超过125 mg/mL，也表现出一定的抑菌效果，不过岳云升等[8]发现大黄对大肠杆菌几乎无抑制作用；苦参对猪大肠杆菌不敏感，其最小抑菌浓度也已超过250 mg/mL。本试验结果与有关文献报导存在一定的差异，主要原因可能是之前的研究与本研究相比，所用大肠杆菌来源不同，其致病力不同，本研究所用的菌种为猪源致病性大肠杆菌。

总之，本试验研究表明，除苦参外，9种中药对猪源大肠杆菌O8都有不同程度的抑制作用，该研究结果对临床应用中药防治猪大肠杆菌病具有一定的指导意义；而根据中药的体外抑菌效果及中兽医理论组方，筛选效果良好的抗菌中药复方需要进一步的研究。

[1] 张鹏飞．中西医结合治疗仔猪黄白痢病[J]．畜牧兽医杂志，2008，27(6)：111-113．

[2] 王晓晖，刘亭岐，陈 波，等．14种中药及其组方对临床常见致病菌的抑菌作用．畜牧与兽医，2009，41(8)：74-76．

[3] Cole M. Key antifungal, antibacterial and anti-insect assays-a critical review[J]. Biochemical Systematics Ecol,1994,22(8):837-856.

[4] Eloff J. A sensitive and quick microplate method to determine concentration of plants extracts for bacteria[J].Planta Medica,1998,64(8):711.

[5] 陈 莉，朱凤静，张春枝． 30种中药水提取物的体外抗菌活性试验[J].大连轻工业学院学报，2005,24(4)：269-271．

[6] 唐志书，李 敏．中药学笔记图解[M]．北京：化学工业出版社，2009．

[7] 李福娟，石学魁，张晓莉，等．苦参、黄连及其配伍的体外抑菌研究．牡丹江医学院学报，2010，31(3)：17-19．

[8] 岳云升，李仲兴，王秀华，等．用新方法对308株临床菌株抗菌活性研究．航空航天医药，2004，15(1)：16-18．

Antibacterial Sensitivity of Chinese Herbal Medicine against SwineEscherichiacoliO8in Vitro

ZHANG Sai-qi, WANG Mi*,LEI Na, YANG Rui-le, XUE Fei-qun

(KeyLaboratoryofAnimalParasitologyofMinistryofAgriculture,KeyOpenLaboratoryofVeterinaryDrugSafetyEvaluationandResiduesResearchofChineseAcademyofAgriculturalSciences,ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,Shanghai200241,China)

Inhibitory effect of 10 kinds of Chinese herbal medicine was explored for swine Escherichia coli O8(E.coli)in vitro by using the agar plate diffusion method and trace double dilution method. The diameter of the inhibitory zone and minimum inhibitory concentration (MIC) was determined. The results showed thatCoptischinensiswas highly sensitive to swineE.coli,the inhibitory zone diameter was 21.3 mm,and its MIC forE.coliO8was 7.813 mg/mL, indicating best inhibitory effect;Scutellariabaicalensis,GallaChinensiswere moderately sensitive with a MIC of 31.25 mg/mL; However,Sophoraflavessentiswas insensitive with MIC to be 500mg/ml, displaying a poor inhibitory effect.

Chinese herbal medicine; swineEscherichiacoliO8; bacteriostatic test in vitro ; minimum inhibitory concentration

2015-02-02

2015-04-02

公益性行业(农业)科研专项(201303040-08)；863计划课题(2011AA2114)；国家自然科学基金(31272607)

张赛奇(1990-) ，男，河南漯河人，硕士，研究方向为中兽药。E-mail：zhangsaiqi0104@163.com

*[通讯作者] 王 米(1975-)，男，四川绵阳人，博士，研究方向：中兽医与中西兽医结合。E-mail:wangmi@shvri.ac.cn; 薛飞群(1956-) ，男，甘肃天水人，研究员，博士，博士生导师，研究方向为新兽药研究与开发。E-mail:feiqun@ gmail.com

S811.6

A

1005-5228(2015)08-0062-04