由R质粒介导的大肠杆菌耐药性及消除

邱美珍， 杜丽飞， 王红兵, 杨 俊,王　慧，周望平，何　平

(湖南省畜牧兽医研究所， 湖南 长沙 410131)

由R质粒介导的大肠杆菌耐药性及消除

邱美珍， 杜丽飞， 王红兵, 杨 俊,王慧，周望平，何平

(湖南省畜牧兽医研究所， 湖南 长沙 410131)

摘要：细菌的耐药性普遍存在，R质粒是介导大肠杆菌耐药性的主要遗传因子。本文就R质粒介导的大肠杆菌耐药性，R质粒的消除做一综述。旨在为细菌恢复对抗生素的敏感性提供参考。

关键词：R质粒；大肠杆菌；耐药性；消除

由耐药质粒(R质粒)介导的耐药性可通过接合、转化、转导等方式在不同菌株之间传递，使敏感菌成为耐药菌，造成R质粒的流行。R质粒的传递使得耐药性在细菌间广泛播散，还使体内部分正常菌群成为耐药基因库[1-3]。细菌耐药形势越来越严峻，许多学者致力于研究细菌耐药性的消除，发现许多理化因素如高温培养、紫外线照射，药物如SDS、中药等具有质粒消除作用[4-6]。本文从R质粒介导的大肠杆菌耐药性，R质粒的消除加以阐述，旨在为恢复细菌对抗生素的敏感性提供参考。

1R质粒介导的大肠杆菌耐药性

大肠杆菌耐药性表现突出，多重耐药也经常发生，R质粒介导的大肠杆菌耐药性主要是其携带了许多的大肠杆菌耐药基因，例如氟喹诺酮类耐药基因、氨基糖苷类修饰酶基因、外排泵基因、16SrRNA甲基化酶基因、ESBLS基因、IntⅠ基因等，由这些基因编码的蛋白介导了大肠杆菌的耐药。

1.1由R质粒介导的大肠杆菌氟喹诺酮类耐药

已知晓的大肠埃希菌质粒介导的喹诺酮类耐药基因(plasmid-mediated quinolone resistance，PMQR)主要有:qnr基因及其不同的等位基因，包括qnrA、qnrS、qnrB、qnrC和qnrD；氨基糖苷乙酰转移酶变异基因aac(6') -Ib-cr；外排泵基因qepA和oqxAB[7]。

qnr(现命名为qnrA1)基因首先发现于一株膜蛋白缺失的肺炎克雷伯菌携带的多重耐药质粒pMG252，随后在膜孔蛋白完好的大肠杆菌中发现质粒pMG252同样能使氟喹诺酮类药物的MIC升高8～64倍，从而证实质粒pMG252上编码了可介导氟喹诺酮类药物耐药的相关基因，对该质粒的深入研究，还先后又发现了其不同的等位基因qnrS、qnrB、qnrC和qnrD[8]。qnr基因仅介导低水平的氟喹诺酮耐药，但携带其耐药基因的菌株比其他菌株更易诱导产生染色体靶位基因的突变，从而导致高水平耐药菌株的快速出现，实验表明携带 pMG252质粒的大肠埃希菌相比不带 pMG252的菌株发生自发突变的概率高100倍。同时质粒介导的qnr基因具有水平传播性，还可以跨种传播，从而导致耐药性的扩散。

aac(6＇)-Ib-cr耐药基因是aa(6＇)-Ib的一个突变体，aac(6＇)-Ib-cr有两个突变点即:102Trp→Arg和179Asp→Tyr。双位点的突变使aac(6＇)-Ib-cr在保持对氨基糖苷类药物亲和的同时还可以与氟喹诺酮类药物亲和，但它对氨基糖苷类药物的亲和力要远大于氟喹诺酮类，Maurice 等[9]认为l79Asp → Tyr的突变和氟喹诺酮药物结合有关。aac(6＇)-Ib-cr通过与哌嗪环上的“NH”发生乙酰化反应降低细菌药物的敏感性，因此aac(6＇)-Ib-cr介导的耐药仅对含哌嗪基氨基氮的环丙沙星和诺氟沙星才具有作用。Robicsek等[10]通过实验证实氨基糖苷乙酰转移酶的变异基因aac(6＇)-Ib-cr编码的灭活酶可引起较高水平的氟喹诺酮耐药。

喹诺酮类药物特异性外排泵基因qepA位于大肠杆菌质粒pHPA，Yamane等[11]在分离大肠杆菌质粒pHPA时发现了一种新的外排泵基因qepA。属于主要易化超家族，它介导了对氟喹诺酮类、氨基糖苷类和广谱 β-内酰胺类药物的耐药。研究证实，携带qepA的菌株对环丙沙星和诺氟沙星的MIC分别提高了32倍和64倍。喹诺酮类药物特异性外排泵基因qepAB，由大肠埃希菌的一种质粒pOLA52编码。oqxAB为多重药物外排泵，它在介导氟喹诺类药物耐药的同时还介导对其他药物(如氯霉素)的耐药。对大肠埃希菌研究时发现 oqxAB基因存在于43～115kb的可转移质粒中，携带该质粒的大肠埃希菌对环丙沙星的MIC提高了16倍[12]。

1.2由R质粒介导的大肠杆菌氨基糖苷类耐药

“什么问题？对不起，我已经忘了。”曾真冷言答道，转身要走，张仲平急忙拦住：“别啊，你可千万不能把你的问题忘了，你一定得想起来，不然我会内疚的，我会遗憾终身的。”

由R质粒介导的大肠杆菌氨基糖苷类耐药基因主要有氨基糖苷修饰酶基因(按功能可分成乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶(ANT)[旧称腺苷转移酶(AAD)]三类，目前已发现的有30余种。)、16S rRNA甲基化酶基因(编码基因为rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和armA 基因)。尽管大肠杆菌氨基糖苷类耐药普遍存在，但耐药机制是不一样的，林宁[13]等对多重耐药的大肠杆菌研究表明，20株E.coli菌株中检出rmtB 16S rRNA甲基化酶基因，aac(3)-II、aac(6′)-Ib和ant(3″)-I三种氨基糖苷类修饰酶基因，并以aac(3)-II和aac(6′)-Ib为主，可见其耐药性主要由16S rRNA甲基化酶基因和乙酰转移酶基因为主介导。而张晶[14]选取氨基糖苷类修饰酶的五种基因acc(6′)-Ib，acc(3)-Ⅳ，aadA，aphA，aph(2″)对7株耐药菌进行PCR扩增，但仅有aphA基因扩增成功，所以初步断定引起这几株菌对氨基糖苷类抗生素耐药的主要机制是aphA编码的磷酸转移酶的作用。由质粒介导的大肠杆菌氨基糖苷类多重耐药及转移也普遍存在，陈燕杰等[15]用PCR和DNA测序方法检测鸭源大肠杆菌多种氨基糖苷修饰酶基因和16S rRNA甲基化酶基因，通过质粒接合试验分析其有关耐药基因和耐药性的质粒接合传递特点，结果表明27株分离菌中的13株检测到rmtB基因，6株同时检测到rmtB和aac(3)-IV基因。质粒接合试验获得5株接合子，接合子对安普霉素、庆大霉素、阿米卡星和新霉素均高水平耐药(MIC≥128μg/mL)，rmtB基因检测呈阳性反应。进一步说明大肠杆菌氨基糖苷类药物耐药和交叉耐药十分严重，质粒介导的rmtB基因和质粒接合传递可能是其耐药及其传播扩散的重要机制。

1.3由R质粒介导的大肠杆菌β-内酰胺类耐药

由R质粒介导的大肠杆菌β-内酰胺类耐药基因主要有ESBLs基因(包括TEM型、SHV型、非TEM型和非SHV型(包括CTX-M型和OXA型))和ampC基因(包括DHA-1型和ACT-1型)，ESBLs和ampC酶目前已成为介导革兰氏阴性杆菌对广谱β-内酰胺类抗生素耐药的两大类主要的β-内酰胺酶。 张珍珍[16]等研究重庆地区动物源大肠杆菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及头孢菌素酶(AmpC)基因型的分布，从临床分离的192株仔猪白痢大肠杆菌、65株奶牛乳腺炎大肠杆菌、69株鸡大肠杆菌中筛选出19株产ESBLs、6株产AmpC酶大肠杆菌，并应用PCR扩增及测序方法进行ESBLs及AmpC基因型分析。结果显示,重庆地区动物源大肠杆菌携带TEM型、CTX-M型、DHA-1 型和CMY-2 型基因的阳性率分别为2.15%、5.21%、0.61%和0.61%。其中,有5株同时携带2种基因。基因分型以TEM型和CTX-M型β-内酰胺酶为主, 且产ESBLs与AmpC酶大肠杆菌为多重耐药菌株。实验还证实，因TEM基因和CTX-M基因位于质粒上，可以通过接合方式发生产酶基因的水平传播，非β-内酰胺类抗生素的耐药性可以与β-内酰胺耐药表型发生共转移，导致多重耐药。因此，尽管目前在兽医临床产ESBLs大肠杆菌的检出率不高，但提醒我们要加强对动物源ESBLs产生菌的监测，以减少对人类医学造成的影响。

1.4由R质粒介导的大肠杆菌氯霉素类耐药

由R质粒介导的大肠杆菌氯霉素类耐药基因主要有IntⅠ基因(Ⅰ型整合子整合酶基因),floR基因和cmlA基因等。郑朝朝[17]对45株不同来源的大肠杆菌氯霉素类耐药基因进行了分析，结果从菌落及质粒DNA中均扩增出了IntⅠ基因，且两者呈现良好的一致性；以菌落及质粒DNA为模板扩增出了floR基因和cmlA基因。从菌落和质粒DNA中扩增的同种基因碱基序列完全相同，floR基因与cmlA基因存在28.2%-28.4%同源性。通过连接、转化构建了基因工程菌,将含耐药基因的重组质粒转入了感受态细菌中，发现含耐药基因的阳性菌对氟苯尼考耐受程度明显增强。George[18]等首次采用Maxicell方法证实了cmlA蛋白位于细菌内膜，并通过主动泵出使氯霉素在菌体内的含量明显减少从而实现细菌耐药。薛原[19]等通过对floR基因与cmlA基因进行同源性分析以及对floR基因进行进化分析。2株猪源大肠杆菌(HZ19 与MZ6)floR基因的同源性为99.2%，与GenBank报道的牛源、鸡源及水源(胶州湾)等大肠杆菌floR基因的同源性为98.8%-99.8%。在系统进化分析中，HZ19与MZ6 不在同一群中。在黑龙江省受试养殖场的60株猪源大肠杆菌中，cmlA基因检出的阳性率为50%，floR基因检出的阳性率为80%。

1.5由R质粒介导的大肠杆菌四环素类耐药

细菌对四环素类耐药主要机制有四类：排出泵系统，核糖体保护因子的表达,一种修饰或钝化四环素的酶及一种未明机制，以前两者为主。大肠杆菌四环素类耐药主要通过耐药质粒或转座子介导并可传递，带有耐药质粒的细菌对四环素类摄入减少或者泵出增加。而由R质粒介导的大肠杆菌四环素类耐药基因主要有核糖体保护基因和外排泵基因(Tet基因)(Tet基因包括：TetM,TetO,TetS,TetB(P)，TetQ，TetT，TetU；OtrA等)。许瑞[20]对临床分离的48株鸭大肠杆菌针对四环素、土霉素、多西环素、氟苯尼考、恩诺沙星、头孢噻肟和阿米卡星共7种药物进行耐药表型和tet基因的多重PCR检测，以代表性tet基因组合的分离菌做供体菌，以利福平耐药的大肠杆菌C600为受体菌，通过质粒接合试验观察tet基因和四环素类耐药性的质粒传递。结果表明48株分离菌全部对土霉素和四环素耐药，耐药率100%，36株对多西环素耐药，耐药率75%；并且以多重耐药为主，鸭源大肠杆菌对四环素类的耐药也存在四环素外排作用、核糖体保护两种特异性机制。tet基因以三种组合(tetA+B+C)和四种组合(tetA+B+C+M)为主。4个tet基因可以同时或不同时通过质粒接合在细菌间转移，使部分受体菌获得对四环素类的耐药性。四环素耐药基因tetM和tetA可以分别由转座子Tn916 和Tn1721及Tn21和整合子IntI一起在鸭大肠杆菌之间进行质粒-质粒传递。

1.6由R质粒介导的大肠杆菌磺胺类耐药

研究表明，由R质粒介导的大肠杆菌磺胺类耐药基因有3种，即su11、su12、su13基因，其编码的二氢叶酸合成酶对磺胺类药物产生抗性。张忠[21]等分析宁夏地区大肠杆菌临床分离株对磺胺类药物的耐药性并PCR法检测了其耐药基因，结果表明，在162株大肠杆菌临床分离株中，127株检测出了耐药基因，阳性率为78.4%。其中，sul1基因的阳性率最高，为65.4%，sul2，sul3基因的阳性率分别为48.1%，1.9%；106株对磺胺类药物的耐药率为65.4%，耐药菌株中有5株未检测到sul1，sul2，sul3耐药基因。药敏实验结果与基因检测结果的符合率为95.3%。所以在临床用药中要根据药敏结果实时调整用药方案。

2大肠杆菌R质粒的消除

大肠杆菌耐药性的产生涉及多种机制，其中大肠杆菌耐药性的增加与自身耐药质粒的产生有着密切的关系。研究发现，R质粒既可产生、传递，也可能因为自身遗传突变、某些理化因素，药物处理而消除，这为控制细菌耐药性提供了一些思路。

2.1理化因子如SDS对R质粒的消除作用

宋坤研究表明[22]紫外线、反复冻融和SDS处理对5株I型整合子基因盒阳性菌的质粒消除率分别达到8%-12%，4%-8%和12%-20%，消除子耐药谱结果显示经处理后5株细菌的质粒全部被消除。对消除子的药敏试验结果同处理前进行比较,可发现细菌的耐药谱发生不同程度的改变，能普遍消除PG,NOR,SXT,CIP,BOX，SM的耐药性。而含卵黄抗体的高免全蛋粉和PH值的改变对细菌R质粒的消除没有影响。

2.2中药对R质粒消除作用

依靠自身突变消除质粒的频率大约是10-6～10-8，几率很小。理化因素对质粒的消除因其副作用太大，在临床上难以应用。中药残留少、抗菌及对耐药质粒的消除作用给人们提供了新的思路，多位学者用单味中药提取物对耐药质粒进行了消除实验，质粒得到了不同程度的消除，鞠洪涛等[ 23]用中草药艾叶的乙醇提取物和蒸馏提取物对大肠杆菌庆大霉素(GM)耐药性及耐药质粒进行了消除试验, 结果艾叶乙醇提取物的消除率最高可达69.4%, 艾叶挥发油的消除率达16.67%。陈群等[24]以中药黄连的提取物为质粒消除剂, 用携带R质粒的多重耐药性大肠杆菌E.O102株为靶细菌, 进行了体外R质粒消除作用的实验研究, 经黄连作用24h，R质粒消除率为2.42%, 延长作用时间至48h, 其消除率提高为22.57%。高迎春等用[28]地锦草提取物作用大肠杆菌前后，对氨基糖苷类药物(庆大霉素、新霉素和大观霉素)的敏感性发生了显著的变化, 对环丙沙星敏感性也发生了变化，使部分耐药大肠杆菌变为敏感菌。研究结果表明, 中药配伍使用, 能够明显增强其消除R质粒的作用。康梅等[25]用三黄片(主要成分为大黄、黄芩总苷、盐酸黄连素)作为质粒消除剂, 对大肠杆菌多重耐药株质粒消除率为31%, 起到抑制细菌耐药性的作用。宁官保[26]等实验发现黄芩、大黄、金银花、黄连、连翘等五种中药单剂和三黄汤、双黄连两种方剂对鸡源大肠杆菌耐药性均表现出不同程度的消除效果，且中药方剂对大肠杆菌耐药性的消除率高于单味中药。质粒图谱分析结果表明，只有黄连和双黄连能引起大肠杆菌质粒谱型的改变，其他中药作用后质粒带均无变化。这提示各味中药对大肠杆菌的抑制机制并不相同。黄连和双黄连造成大肠杆菌6 670bp和210bp两条质粒带消失，推测鸡大肠杆菌携带6 670bp和210bp的质粒介导了对环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星等耐药性的产生。黄连和双黄连可以通过消除耐药质粒基因的办法提高对大肠杆菌耐药性的清除率。黄芪、大黄、金银花等中药则可能通过其他途径实现对大肠杆菌耐药性的清除，这些途径可能涉及整合子、转座子、染色体等遗传物质的改变。

2.3噬菌体对大肠杆菌耐药性的影响

噬菌体(bacteriophage)于1917年首次被发现，是指一类能特异性感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称。许多双链DNA噬菌体采用裂解酶和穿孔素-双组分裂解系统，这两种功能蛋白从宿主菌内部裂解细菌并释放子代噬菌体[27]。噬菌体在解决大肠杆菌耐药性方面也是值得期待的，大肠杆菌λ噬菌体裂解酶不能穿过完整的细胞膜，需要依赖同源的穿孔素S105发挥裂解功能；但有些具有N--末端信号肽功能的多种裂解酶则不依赖于穿孔素的作用，可以通过自主运输缓慢裂解细菌细胞壁。吕萌[28]等分离得到1 株具有较强裂解能力的大肠杆菌噬菌体vB_EcoM-ep3。测序后发现其裂解酶基因与绿脓杆菌噬菌体裂解酶具有很高同源性。其编码的裂解酶与柠檬酸配合使用，对大肠杆菌和绿脓杆菌均表现出较好的裂解能力，作用从2～24h持续有效，细菌数量分别下降7.2倍和17.3倍。该研究为解析裂解酶结构与功能的关系提供了一个良好的例证，同时有助于开发大肠杆菌噬菌体裂解酶的广谱性改造。但胡彦明[29]等发现质粒的存在使细菌对某些噬菌体的感染产生抗性。其中有些抗性的产生是因为噬菌体不再吸附到大肠杆菌细胞的表面,有些则是其他原因所致。因此，噬菌体在解决细菌耐药性的同时，可能也会产生新的耐噬菌体菌株，而且噬菌体的抗菌谱，安全性等还有待进一步深入研究。

3展望

大肠杆菌耐药性呈多重耐药现象，它的产生涉及到多种机制，其中大肠杆菌耐药质粒的产生与大肠杆菌耐药性的增加关系密切。大肠杆菌携带的R质粒可遗传，可在不同菌株、菌种间传递，使得耐药性细菌持续增加、流行。对各菌株R质粒耐药谱型进行分析，揭示大肠杆菌耐药性与耐药质粒的关系，提供消除R质粒的思路和方法，还原细菌对抗生素敏感性是目前研究的热点。因此在深入研究其耐药机制，研制新型抗菌药物的同时更应该严格掌握细菌的耐药性特点，根据患病动物(人)情况、药敏结果等选择抗菌药物以及其剂量和疗程，从而减少耐药菌株的产生。相信随着抗生素的少用、合理使用，加大抗耐药性细菌感染药物的研制力度，尤其对一些具有良好应用基础的中药进一步开发，耐药性细菌感染的世界难题可迎刃而解。

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The Drug Resistance and Elimination Mediated by R Plasmids fromEscherichiacoli

QIUMeizhen,DULifei,WANGHongbing,YANGJun,WANGHui,ZHOUWangping,HEPing

(Hunan Institute of Animal and Veterinary Science, Changsha 410131, Hunan, China)

Abstract：It is widespread on the drug resistance of bacteria, R plasmid is a major genetic factor mediating drug-resistant of E. coli. It is reviewed by the Drug Resistance and Elimination of R Plasmids from Escherichia coli.The aim of the paper is to provide reference for bacteria to restore their sensitivity to antibiotics.

Key words：R plasmid; E.coli; drug resistance; eliminate

文章编号：1007-7146(2015)06-0500-06

文献标志码：A

中图分类号：S853.7

作者简介：邱美珍(1974-)，女，湖南娄底人，硕士，副研究员，主要从事微生物研究。(电话)0731-84620761；(电子邮箱)156278198@qq.com

基金项目：湖南现代农业产业技术体系生猪创新团队项目(湘农业联[2010]125号)；湖南省自然科学基金 (12JJ3032)

收稿日期：2015-08-11;修回日期:2015-09-11

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.06.002