匹伐他汀对野百合碱诱导大鼠肺动脉高压的作用及机制研究

周述博，张本斯

（大理学院，云南大理 671000）

肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是在多种致病因素下使肺血管阻力增高及肺顺应性减退并肺血管重塑，最终发展为右心衰竭的一种病理生理过程〔1〕。具体的发生机制尚不完全清楚，已证实多种体液因素如内皮素及生长因子等参与肺血管纤维化的发病过程，并使肺血管平滑肌细胞的增殖。

匹伐他汀属于他汀类药物的新型降脂药。他汀类药物现已被证实有抗血管平滑肌增殖、抗炎、抗凋亡及对小G蛋白翻译后的修饰有抑制作用及中断细胞内信号的传导〔2〕，其中小G蛋白是一种具有GTP酶活性且分子量小的蛋白。Rac1是小G蛋白的一个亚群，血小板衍生生长因子B（platelet-derived growth factor B，PDGF-B）在血管平滑肌增殖中起重要的调节作用，白介素6（interleukin-6，IL-6）是一种重要的炎症介质。所以本文通过Rac1、PDGF-B、IL-6相互研究来进一步阐明肺动脉高压形成及匹伐他汀在对肺动脉高压的治疗机制，尤其是通过对Rac1基因的表达来介导PDGF-B、IL-6因子的产生是本研究的新颖点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料

1.1.1 动物 雄性SD大鼠，体重（253.8±14.2）g，实验动物由昆明动物实验中心提供，合格证号为602023。

1.1.2 器材 大鼠右心导管（大理学院生理学教研室），PCR扩增仪（德国Eppendorf公司），荧光定量PCR（Applied Biosystems公司的7700型）。

1.1.3 试剂 野百合碱（上海纯优生物有限公司，批号：P1014）；匹伐他汀（日本 Kowa Company，Ltd，批号：H20130101）；大鼠PDGF-B抗体（Bia-Swamp公司）；二抗及DBA显液试剂盒（上海基尔顿生物制剂公司）；IL-6 Elisa试剂盒（美国 Rapidbio）；TRIZOL试剂（天根公司）。灌胃液均按每组设定的匹伐他汀的量用灭菌水稀释至2 mL。

1.2 动物分组方法及干预 50只雄性SD大鼠，体重（253.8±14.2）g，随机均分为5组，分别为空白组、模型组、匹伐他汀预防组（1 mg/（kg·d））和匹伐他汀高剂量（3 mg/（kg·d））治疗组、低剂量（1 mg/（kg·d））治疗组〔3〕。除空白组外其余各组均通过皮下注射野百合碱诱导大鼠形成肺动脉高压〔4〕。其中预防组自野百合碱皮下注射当日起每日给予匹伐他汀（1 mg/（kg·d））灌胃至第8周末。匹伐他汀高剂量组（3 mg/（kg·d））和低剂量组（1 mg/（kg·d））在第4周末开始给予匹伐他汀相应剂量灌胃至第8周末。模型组和空白组生理盐水灌胃至第8周末。

1.3 肺动脉压的测定 用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠后，参照孙波等〔5〕方法，血流动力学测定主要记录平均肺动脉压（mPAP），用右心导管及生理记录仪记录。

1.4 肺动脉形态学观察 取右中肺约200 mg，经石蜡切片、HE染色后，显微镜下双盲阅片，对肺小动脉管壁厚度进行统计学分析，每张切片均选取3～5个肺小动脉进行测量血管内外径，其差值为血管壁厚度（WT），血管壁厚度百分比=（管壁厚度×2）／外径×100%，计算其平均值。

1.5 右心室肥厚的判断 将心脏分离为右心室游离壁（RV）和左心室加室间隔（LV+S），用滤纸吸干后称其重量，计算RV／（LV+S）比值，判断右心室的肥厚程度。

1.6 肺组织中血小板源性生长衍生因子-B（PDGFB）免疫组化染色和结果判断 取肺组织经石蜡切片后经免疫组化染色，依次脱蜡、抗原修复、用过氧化氢消除内源性过氧化物酶、滴加一抗、再滴加二抗、DAB（偶氮变色酸）显色等步骤。以棕黄色反应物为阳性信号，每张切片选取直径100～150 μm肺小动脉3～5支，染色深浅表示PDGF-B的表达强度。

1.7 RT-PCR法检测肺组织Rac1的mRNA 引物合成由天根公司完成。Rac 1引物序列：上游5'-CCTGCTCATCAGTTACACGAC-3'，下游 5'-GACGCAG-TCTGTCATAATCTT-3'，扩增片段长度为180 bp。β-actin基因为内参照，上游5'-CACCCGCGAGTACAAC CTTC-3'，下游5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'，扩增长度片段为244 bp。PCR过程按照说明书上进行，扩增条件如下：①95℃3 min预变性；②95℃20 s变性，60℃30 s退火延伸，40个循环。实时荧光定量PCR分析：分别测定每个样品Rac1和β-actionmRNA的Ct值，为了减少操作误差，将每个样品均作复孔。Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时经历的循环数。采用相对定量方式表示各样品Rac1的ΔCt。再按照ΔΔCt＝ΔCt目的基因-ΔCt参照基因，计算 2-ΔΔCt。在对PCR反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时监测的过程中，根据扩增曲线确定Ct值，利用2-ΔΔCt法计算Rac1相对拷贝数。

1.8 ELISA检测肺组织中IL-6 取100 mg已冻存的肺组织剪碎，取0.9 mL灭菌水稀释匀浆后，2 000 r/min离心10 min，取上清50 μL用于检测，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.9 统计学处理 实验重复检测3次，使用SPSS16.0统计学软件进行统计学分析，计量资料采用（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物一般状况 预防组、空白组大鼠均存活。空白组大鼠强壮、呼吸平稳；模型组、低剂量组、高剂量组大鼠，在腹腔注射野百合碱1周后，3组大鼠较空白组均有不同程度地出现活动减少，食量减少，至第2周末开始出现体重下降，部分大鼠出现喘息，第3周末上述症状更严重，鼻、唇紫绀，至第4周末时模型组和高剂量组各死亡1只，低剂量组死亡2只；高剂量组、低剂量组在4周末后给予匹伐他汀治疗后，大鼠呼吸逐渐平稳，体重开始增加，并且高剂量组优于低剂量组；至8周末时模型组共死亡6只，高剂量组死亡2只，低剂量组死亡4只，预防组死亡2只，空白组无死亡。肺动脉高压形成之后匹伐他汀治疗能显著改善生存率（低剂量组、高剂量组与模型组比较为60%、80%比40%），解剖死亡大鼠，可见胸腔积液、肺部淤点淤斑，且可见右心室游离壁明显肥厚。

2.2 肺动脉压的测定和肺小动脉形态学、右心室肥厚判定 模型组与空白组相比较，mPAP值、肺小动脉管壁增厚程度及右心室肥厚程度显著升高（P均＜0.01）；模型组与预防组、高剂量治疗组、低剂量治疗组相比较，mPAP值、肺小动脉管壁增厚程度及右心室肥厚程度也升高（P均＜0.01），而预防组、高剂量治疗组、低剂量治疗组组间比较上述指标差异亦有统计学意义（P均＜0.05）。见表1及图1。由图1可知模型组大鼠肺小动脉管壁厚度明显高于其他组。

2.3 肺组织中PDGF-B的表达情况 与模型组比较，高剂量治疗组及低剂量治疗组、预防组不同程度地抑制了PDGF-B的基因表达，均明显低于模型组（P均＜0.01），高剂量治疗组及低剂量治疗组间上述指标差异具有统计学意义（P均＜0.05）。见表1及图2。由图2可知模型组大鼠肺小动脉管壁PDGFB明显高于其他组。

2.4 实时荧光定量PCR检测及ELISA检测 结果显示，Rac1 mRNA的表达在空白组中较低，预防组和治疗组较高，模型组最高。与模型组比较，各组值明显降低（P均＜0.01）；IL-6的表达量同样是模型组最高，与模型组比较，各组值明显降低（P均＜0.01）。见表1。

表1 实验各组大鼠各指标的比较（±s，n=10）

表1 实验各组大鼠各指标的比较（±s，n=10）

注：与模型组比较aP＜0.01，bP＜0.01，cP＜0.01，dP＜0.05，eP＜0.01，fP＜0.01；与高剂量组比较gP＜0.05，hP＜0.05，iP＜0.05。其中，l mm Hg=0.133 3 kPa。

指标平均肺动脉压/mmHg肺小动脉血管壁厚度/%右心室肥厚程度血小板源性生长衍生因子-B表达阳性率/%肺组织Rac1 mRNA表达阳性率/%白介素6/(ng/L)空白组17.32±1.21 18.87±3.12 0.34±0.01 12.92±2.47 0.97±0.12 35.69±3.62预防组24.20±2.31a 35.37±2.15b 0.37±0.01c 19.30±3.62d 1.57±0.28e 54.38±2.37f高剂量组25.70±2.56a 41.04±3.70b 0.38±0.02c 17.38±2.78d 1.53±0.20e 50.18±4.27f低剂量组28.49±3.39ag 37.28±1.04bh 0.40±0.01ci 24.27±2.63d 1.71±0.11e 65.12±4.86f模型组36.18±4.51 57.01±4.38 0.55±0.02 35.42±4.10 1.96±0.25 87.49±5.28

图1 大鼠肺小动脉病理切片图（HE，×400）

图2 大鼠肺小动脉PDGF-B免疫组织化学染色结果（ISH，×400）

3 讨论

PAH是临床常见的病理生理的过程，常继发于心肺等多种疾病，目前对于PAH发病机制及治疗的研究有很大程度的提高〔6〕。随着细胞和分子水平研究深入，在对肺动脉高压的发病机制及病理生理的研究有了较大的突破，新的治疗药物及方法也逐渐增多，其中他汀类的药物就是其中的一种。他汀类药物为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂。大量的研究证实〔7-8〕他汀类药物具有较多的降脂外作用，包括抗血管平滑肌细胞增殖、抗凋亡作用、抗氧化作用、抑制炎性因子产生等作用。

一方面，他汀类药物强大的抗炎作用在很多方面已经得到证实，但是匹伐他汀的抗炎作用在对肺动脉高压的治疗尚未具体报道。在本实验设计构思中假设它有抗炎作用，研究能否通过抗炎作用逆转肺动脉高压的形成；在通过对大鼠肺组织中的炎症介质IL-6的检测，结果证实匹伐他汀可以减少肺组织中IL-6的分泌，从而可以产生抗炎作用，并能在一定程度上逆转肺动脉高压的发生。IL-6作为一种炎症介质，在炎症的发生、发展过程中有着重要的地位〔9〕。目前，PAH发生机制虽未明确阐明，但认为IL-6自身可介导肺血管平滑肌免疫和炎性反应，并产生大量如C-反应蛋白等急性炎性反应产物；促进诱导型一氧化氮合成酶增加，使心肌环磷酸鸟苷（cGMP）水平升高，钙内流减少，最终出现肺动脉弹性减退，所以在肺动脉高压的进展中，由于各种因素导致炎症反应，引起IL-6在肺组织分泌增加，而IL-6又可进一步损害肺动脉，由此形成恶性循环。

另一方面，有报道证实〔10〕他汀类药物可以影响血管平滑肌细胞的增殖和迁移，且能有效治疗肺动脉高压。推测可能的机制是与其诱导肺动脉平滑肌细胞或血管内皮细胞凋亡、抑制靶细胞增殖有关，但是在肺动脉高压的进展中，有关对肺动脉平滑肌细胞增殖的细胞因子暂未具体阐明。在本实验中，通过对各组大鼠肺组织PDGF-B表达量的测定，结果表明对已诱导形成肺动脉高压的大鼠肺组织PDGF-B的表达量较正常大鼠多，由此可以推测得出，PDGF-B的表达增多在一定程度上促进肺动脉平滑肌细胞增殖。并且在使用匹伐他汀干预治疗后，PDGF-B在肺组织中的表达量较模型组少，可以进一步得出匹伐他汀能够通过抑制PDGF-B的表达而逆转肺动脉高压的进展。PDGF-B是由巨噬细胞产生，主要促进细胞增殖及平滑肌纤维化〔11〕。所以可以推导，在肺动脉高压形成过程中，多种因素使肺组织产生炎症反应、巨噬细胞增多，而增加PDGF-B表达，从而使肺动脉增殖。

最后，在肺动脉高压的进展和匹伐他汀对肺动脉高压治疗中，具体是通过什么基因片段来调控IL-6和PDGF-B在肺组织中分泌和表达的尚不清楚。通过前期对小G蛋白（GTP激酶）的研究发现，Rho家族成员中的GTP激酶（Rho GTP ases）是Ras GTP激酶（Ras GTPase）超家族的一个主要分支，目前在哺乳动物细胞中发现有8个亚群，共22种，Rac就是其中的一个亚群，并且Rac1是广泛表达并且研究最多的亚型〔12〕。有文献〔13〕表明，各种因素如缺氧引起肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）Rac1激活，介导血管内皮细胞产生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），ROS生成及PASMCs增殖促进肺动脉高压形成〔14〕。在该实验中把Rac1与PDGF-B、炎症介质IL-6共同研究旨在进一步阐明肺动脉高压的进展和匹伐他汀对肺动脉高压治疗的具体机制。

通过实验结果中可以推测肺动脉高压形成及匹伐他汀干预治疗的可能部分机制：在肺动脉高压发生的各种致病因素如缺氧诱导肺血管的Rac1激活，进而介导细胞外向细胞内信号传导，引起PDGF-B的表达，促进肺血管增殖及炎症介质的产生如IL-6而发生炎症反应，导致肺血管重塑。另外研究〔15〕表明，缺氧诱导Rac1激活，可介导ROS后诱导内皮细胞NF-kB1激活，而活化的NF-kB1可进一歩激活炎性因子IL-6，而IL-6又能诱导ROS的大量产生，形成恶性循环，导致血管内皮细胞炎性损伤、发生凋亡。本实验结果也与此相符。但是在肺动脉高压的发生过程中，具体Rac1对肺组织中IL-6产生及PDGF-B的表达具体怎么调控，还有待进一步的研究。

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