纳米磁分离技术在食品微生物快速检测领域的应用

甘 蓓 胡晓云 胡文斌 甘冬兰

(1.江西省产品质量监督检测院，江西南昌 330029;2.江西省食品检验检测研究院，江西南昌 330046;3.南昌大学图书馆，江西南昌 330029)

1、食品微生物快速检测

食品安全检测的对象包括:药物残留(含农药、兽药)、非法添加物、重金属污染、有机污染物、生物毒素以及微生物污染。

由于食品中组分复杂，而目标分析物的含量较低。因此，除微生物外的目标分析物，往往要通过复杂的样品前处理过程，达到分离和纯化，然后再进行仪器分析。在样品前处理过程中，萃取、过滤、过柱、旋转蒸发、氮吹等等一系列繁琐步骤不可避免;而且自动化程度低，对人员要求较高;有机试剂消耗大，对环境造成不可避免的污染。

而微生物污染，往往采用传统方法分离，通过增菌、选择培养、分离纯化、生化鉴定和血清鉴定等步骤，过程繁琐耗时长。通常需要3～7天，更有甚者长达10天时间。

在食品安全事件频发的今天，快速检测已成为一种趋势。为了满足需要，食品微生物检测朝着检验时间短、操作简单、更加环保的方向发展。随着分子生物学技术、免疫学分析检测技术、生物传感器技术和纳米磁分离技术等新技术在食品安全检测中的应用，使得食品微生物快速检测技术迅速发展。

2、纳米磁分离技术

纳米技术是20世纪80年代发展起来的一门多学科交叉融合的技术科学。随着纳米技术的发展，磁性纳米粒子开始走入科研人员的视野。磁性纳米粒子(Magnetic Nanoparticles，MNPs)是指含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末且具有磁响应性的纳米级粒子，具有独特的超顺磁性能［1］。磁分离技术(Magnetic Separation，MS)正是借助了磁性纳米粒子的超顺磁性，通过对磁性纳米颗粒的表面修饰，使纳米粒子既具有功能化基团，又具有磁性。通过功能化基团与目标物质之间的特异相互作用，以及外加磁场作用，实现对靶向目标物质的快速分离［2］。

磁性纳米粒子用于微生物检测分析过程具有以下几个方面的优势:

(1)粒径小，不容易发生沉降;悬浮稳定性好，能高效地与目标产物进行偶联;且具有较大的比表面积，吸附容量大。

(2)具有超顺磁性:在外加磁场的存在下，磁性微粒有较好的响应性，能迅速聚集，当撤去外加磁场时，磁性微粒无磁性记忆，能够均匀分散，不出现聚集现象。

(3)具有丰富的表面活性基团，可以特异结合各类具有生物活性的物质，如生物酶，蛋白质等;也可在其表面结合特异性靶向分子，如特异性抗体等进而应用于致病性微生物的分离。

(4)操作简便，在外磁场的作用下便可进行磁粒的反复分离，分离过程十分简单，可省去离心，过滤等繁琐操作，节约时间，与目前已有微生物检测方法相比，具有较好的优势。

(5)磁性微粒具有一定的机械强度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的降解。对微生物检测中的样品没有特别的要求，不需要调节样品溶液的pH。

磁性微球制备方法:共沉淀法、悬浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及原子转移自由基聚合法等。常用的磁性纳米粒子的表面修饰物主要有非聚合物、聚合物、无机物和目标配体等［3］。修饰物可以通过表面聚合、表面化学连接、吸附沉积、包埋等方法与磁性纳米粒子结合，达到降低粒子表面能、调节粒子分散性和生物亲和性、提高与目标检测物质结合性的目的。

3、磁分离技术在食品微生物快速检测领域的应用

3.1 食品微生物检测中常见的致病菌

食品中常见的微生物检测主要是菌落总数、大肠菌群和致病菌检测，其中致病菌鉴定周期长、步骤繁琐。食品中致病菌主要有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、溶血性链球菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌O157:H7、产气荚膜梭菌、铜绿假单胞菌和粪链球菌等。

3.2 磁分离技术分离致病菌的原理

磁分离技术在食品微生物检测中的应用，主要是通过磁性纳米材料的表面生物修饰达到富集。将生物亲和分子修饰到磁性纳米材料的表面，通过生物亲和分子捕获样品溶液中的目标菌，使目标菌带有磁性，从而达到易分离的目的。目前，磁性纳米材料捕获致病菌的方式主要有四类，一是利用抗原－抗体反应;二是凝集素－受体反应;三是抗生素识别反应;四是DNA互补序列识别反应［4］。目标菌通过结合磁珠，在外加磁场的作用下，与样品溶液分离。通过不同的检测手段(如传统平板计数、ATP生物发光分析、生物传感器技术、PCR技术、红外光谱、荧光光度计等)，最终达到从各类基质中分离并检测食品中食源性致病菌的目的。

3.3 磁分离技术在食品微生物快速检测领域的应用实例

3.3.1 大肠杆菌 O157∶H7

利用抗原抗体反应原理制成的免疫磁珠分离大肠杆菌O157∶H7，已经被英国公共健康服务实验室认定为标准的分离方法。我国也已将免疫磁珠法对大肠杆菌O157的检测纳入国家标准(GB/T 4789.36－2008)和出入境检验检疫行业标准(SN/T 1059.5－2006)。Decory等建立了免疫磁珠－免疫脂质体(IMB/IL)荧光试验方法，可在8h内快速检测出多种液态样品(水样、苹果汁、苹果酒)中低至1cfu/mL的 E.coli O157∶H7。［5］

3.3.2 单增李斯特菌

传统的单增李斯特菌检测方法检测周期长，约5～14d，步骤繁琐且灵敏度低，而免疫磁分离技术的优点在于在较低的菌液浓度时也可以通过免疫磁珠的富集作用进行检测，缩短了检测时间并进一步降低了单增李斯特菌的检测限。2008年，我国将免疫磁珠检测单核细胞增生李斯特菌的方法纳入了出入境检验检疫行业标准中(SN/T 0184.3 －2008)。

较传统分离技术而言，磁分离技术大大缩短了食品微生物检测的时间，通过与生物传感器技术、ATP生物发光分析等技术的结合，较容易实现食品微生物检测的自动化。节省大量人力物力。

3.3.3 金黄色葡萄球菌

陈伶俐等将人IgG结合到磁珠上，用该磁珠对样品中的金黄色葡萄球菌进行快速分离检验。对磁珠所涂平板的菌落进行鉴定，证明为金黄葡萄球菌。同时用大肠杆菌和白葡萄球菌进行对照，发现应用此法分离检验金黄色葡萄球菌，富集速度快，灵敏度高，效果好。［6］刘琳琳利用自制的金属螯合免疫磁珠来检测食品中金黄色葡萄球菌，该法能够在30min内富集检测金黄色葡萄球菌且检测低限可达100 CFU，同时磁珠可保持活性达3周以上。［7］

综上所述，磁性纳米技术越来越多应用在食品微生物检测领域中，使得今后的食品微生物快速检测能够实现快速、在线检测。

［1］朱屯，王福明，王习东.国外纳米材料技术进展与应用［M］.化学工业出版社，2002，6:69－77.

［2］SAFARIK I，SAFARIKOVA M.Magnetic nanoparticles and biosciences［J］.Monatshefte für Chemie，2002，133(6):737－759.

［3］AGUILAR － ARTEAGA K，RODRIGUEZ J A，BARRADO E.Magnetic solids in analytical chemistry:a review［J］.Analytica Chimica Acta，2010，674:157 －165.

［4］黄小林，许恒毅，熊勇华，等.磁性纳米材料在食源性致病菌分离中应用的研究进展［J］.食品科学.2014，35(11).

［5］DECORYTR，DURSTRA，ZIMMERMANSJ，etal.Development of animmuno magnetic bead－immunoliposome fluorescence assay for rapid detection of Escherichiacoli O157:BH7 in aqueous sample sand comparison of the assay with a standard microbiological method［J］.Applied and Environmental Microbiology，2005，71(4):1856 －18641.

［6］陈伶俐，刘琳琳，曾力希，等.金黄色葡萄球菌及SPA快速分离检验新技术的研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2011，19(2).112 －114.

［7］刘琳琳.免疫磁性微球快速分离检验金黄色葡萄球菌新技术的研究［J］.山东医学高等专科学校学报，2011，39(7):579 －615.