冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗制备及其对体液免疫的效果

田 文 裴银辉 李 琳

(华北理工大学基础医学院 河北唐山 063000)

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)简称淋球菌(Gonococcus)，是引起淋病的病原菌，革兰染色阴性，常成双排列，无鞭毛、芽孢，有荚膜和菌毛，可携带多种质粒。人类是淋球菌的自然宿主。淋病具有潜伏期短、传染性强、社会危害性大等特点，主要通过性生活传播，也可通过污染的衣裤、床上用品、毛巾、浴盆、马桶等间接传播[1]。目前常用的抗生素治疗虽然可以缩短淋球菌感染持续时间并减少其传播，但近年来随着淋球菌耐药菌株的不断出现，抗生素治疗淋病的耐药现象日趋严重，迫切需要寻找有效预防措施，但目前尚无临床应用的淋病奈瑟菌疫苗。淋球菌在进化过程中形成了一套逃避人体免疫系统的机制，制备淋球菌疫苗进行主动免疫预防较困难。尽管如此，人们仍在不懈地研制淋病奈瑟菌疫苗。多年以来，相关学者通过对淋球菌灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗等的深入研究，不断探索高效的疫苗靶位用于淋病的预防和控制，有力地推动了淋病奈瑟菌疫苗的研究。A群脑膜炎球菌多糖疫苗已广泛应用于临床实践，使全国流脑发病率持续下降，取得了明显成绩[2]。淋病奈瑟菌与脑膜炎球菌同属奈瑟菌属，具有许多共性，由此可设想淋病奈瑟菌多糖疫苗的制备具有可行性。本研究旨在通过制备淋球菌多糖抗原，将多糖抗原与完全弗氏佐剂乳化共同免疫家兔，评价其在动物中的免疫效果，为制备淋球菌主动免疫制剂提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。CMCC29403 WⅡ/WⅢ血清型，购于中国药品生物制品检定所，通过革兰染色镜检、氧化酶、触酶和自溶试验等初步鉴定，符合淋球菌典型形态和生化特征。

1.1.2 主要试剂。0.5%甲醛生理盐水;十六烷基三甲基溴化铵;2mol/L氯化钙溶液;1/10饱和中性醋酸钠溶液;冷酚;0.1mol/L氯化钙溶液;75%乙醇;95%乙醇;无水乙醇;丙酮。

1.1.3 弗氏完全佐剂(自制)。成分:羊毛脂10g，液体石蜡45mL，卡介苗75mg/mL(每支卡介苗加1mL蒸馏水稀释混匀)。方法:将羊毛脂和液体石蜡加温(水浴)置研钵中，然后将卡介苗加入研钵，边加边研磨，研磨均匀，分装小管，8磅高压20min备用。

1.1.4 实验动物。体质量约5kg的健康成年雄性家兔16只，适应性喂养1周，称重编号后随机分为低剂量免疫组和高剂量免疫组，每组8只。

1.2 多糖提取[3～6]

1.2.1 淋病奈瑟菌培养与扩增。使用平板划线法将淋球菌接种于巧克力培养基，37℃环境烛缸培养48h。

1.2.2 去核酸。收获淋病奈瑟菌后以0.5%甲醛灭菌，4000r/min，离心15min，收集上清液，于上清液中滴入数滴十六烷基三甲基溴化铵。室温下过夜，13000r/min，离心30min，收集沉淀物。沉淀物溶于2mol/L氯化钙溶液，至终浓度为1mol/L，摇动1h，充分解离多糖十六烷基三甲基溴化铵。加入75%乙醇至终浓度为25%(v/v)，过夜，16000r/min，离心15min去沉淀，收集上清液。

1.2.3 沉淀多糖。于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度为80%(v/v)，充分振摇。沉淀多糖，16000r/min，离心30min，收集沉淀多糖，然后用无水乙醇及丙酮各洗涤2次，第1次13000r/min，离心5min;第2次16000r/min，离心30min。将沉淀物(多糖粗制品)保存在－20℃以下备用。

1.2.4 多糖的精制及鉴定。将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10～20mg/mL，然后将1倍体积多糖上清液加入2倍体积冷酚充分振摇，重复提取3次。然后16000r/min，离心10min，收集最上层澄清液体，重复3次并用0.1mol/L氯化钙溶液透析。透析后离心，于上清液中加乙醇至最终浓度为75%～80%(v/v)。16000r/min，离心30min，收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗涤2次。用无热原蒸馏水溶解沉淀多糖，以α－萘酚法鉴定。

1.3 免疫程序

1.3.1 免疫。初次免疫:用2mL注射器吸取经FCA乳化的抗原1.0mL。同时在兔的肩胛部选4～6点进行多点皮下注射，每点注射约0.2mL。低剂量免疫组抗原的组成为多糖200μL加0.5mL FCA乳化;高剂量免疫组则用多糖500μL加0.5mL FCA乳化;第2次免疫:间隔14d后，于家兔大腿内侧肌肉注射用FCA乳化的抗原1.0mL，多点注射;第3和第4次免疫:分别间隔7d后，注射方式及剂量同第2次免疫。

1.3.2 兔免疫血清效价测定。末次免疫后第7天，耳缘静脉采血，分离血清，应用絮状沉淀试验测定实验家兔血清中特异抗多糖抗体效价。

1.4 统计学处理 将资料进行变量变换，取几何均数，应用独立样本的t检验进行两组均数比较，检验水准取双侧 α=0.05。

2 结果

2.1 多糖鉴定 α－萘酚法结果表明，在多糖溶液与浓硫酸两液面间出现红紫色的环，表明获得沉淀物为多糖。

2.2 低剂量免疫组与高剂量免疫组动物血清中淋病奈瑟菌多糖抗体效价的测定 应用完全弗氏佐剂以增强抗体对抗原的免疫应答强度。经过4次免疫，两组实验动物健康，肩胛部红肿但未见炎症，其血清中淋球菌多糖抗体效价见表1。

表1 两组实验动物血清中淋球菌多糖抗体效价测定结果

经t检验，两组实验动物血清中淋球菌多糖抗体效价差异不具有统计学意义(P＞0.05)，说明低剂量多糖抗原与高剂量多糖抗原免疫效果一致。

3 讨论

疫苗是能够刺激机体产生特异性抗体或激活免疫细胞，以抵御外来病毒、寄生虫和细菌入侵的一类特殊的生物制品。目前人用细菌性疫苗主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗、多糖疫苗、多糖蛋白结合疫苗、基因工程蛋白疫苗和类毒素等[7]。人类缺乏对淋病奈瑟菌的先天免疫力，普遍存在易感性;并且感染淋病奈瑟菌后机体难以产生有效的特异性免疫，可反复感染。人们在全细胞疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗的研究中发现:全细胞疫苗接种次数多，不良反应大，可能有回复毒力危险;亚单位疫苗部分抗原的免疫原性较弱;DNA疫苗存在一些安全性问题[8]。随着医疗技术的不断发展，淋球菌疫苗的研究将进入新阶段。本研究旨在通过制备淋病奈瑟菌多糖抗原，评价其在动物中的免疫效果。

本实验采用烛缸法培养淋球菌，其对数生长期细菌的生长状态、致病性、传染力均为最佳，是最适合研究的时期，因此在此期收获淋球菌最为适宜。淋球菌在温度低于30℃或高于38.5℃生长停止，一般在35℃～37℃环境培养24～48h。培养时间过长会发生细菌自溶，菌体蛋白析出，增加精制难度。在提取多糖过程中使用了对多糖具有较强沉淀作用的十六烷基三甲基溴化铵，又利用氯化钙不同的浓度解离多糖十六烷基三甲基溴化铵，同时氯化钙在酒精中对核酸有助沉淀作用，进一步去除核酸。沉淀多糖过程中运用相似相溶的原理，利用丙酮反复多次将多糖中的脂肪抽提出来，并除去。精制多糖时，加入2倍体积冷酚的溶液中具备了适合的蛋白浓度，溶液变乳浊。

Anderson[9]证实了革兰阴性菌外膜的脂多糖(内毒素)结构不够稳定，因此，在制备淋病奈瑟菌多糖抗原时，不可避免地会被自身的脂多糖所污染。脂多糖的污染可导致荚膜多糖菌苗的毒性增加，故必须进一步进行去污染处理。去除脂多糖主要依赖长时间的超速离心处理。本研究中采用25000r/min，离心18h，脂多糖即可与荚膜多糖分离而沉淀，从而达到去除脂多糖的目的[10～13]。

家兔产生有效抗体的过程有一定的时间规律，通常，B细胞对抗原的初次抗体应答潜伏期在10d左右，再经10d左右抗体产生才达到峰值，但产生的抗体水平不高，亲和力不强，抗体以IgM为主，因此不能形成对机体长期有效的保护，但形成了记忆淋巴细胞[14]。而再次抗体应答中由于抗原刺激的是记忆细胞，抗体产生的潜伏期只有2～3d，再经3～5d抗体即达到峰值，产生高效价、高亲和力、体内持续时间较长的以IgG为主的抗体，能有效保护机体不受病原体感染。通常会依据这一规律采用间隔2周以上的多次免疫程序。抗血清效价一般在免疫后4～6周为最高。在注入抗原的同时加入了FCA是为了增强抗体对抗原的免疫应答强度。同时，延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用时间。

本实验首先应用冷酚法提取淋病奈瑟菌多糖抗原，并借助弗氏完全佐剂共同免疫家兔。根据抗原免疫剂量，分为低剂量组和高剂量组，评价低剂量和高剂量抗原体液免疫效果的差别，为进一步疫苗应用中剂量选择提供实验依据。本研究结果表明，低剂量免疫组和高剂量免疫组的抗体效价分别为(1:381±0.004)和(1:269±0.008)，经统计学分析两组间抗血清的效价无统计学差异，使用低剂量的多糖抗原可达到与高剂量抗原相同的免疫效果。因此，淋病奈瑟菌多糖可以作为淋病奈瑟菌主动免疫制剂候选成分抗原。

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