PEG－6000胁迫对枳壳种子萌发生理特性的影响

吴云忠，杨雪莲，孙嘉怡

（贵州大学，贵州 贵阳550025）

1 引言

我国柑橘种植面积和总产量均居世界首位，柑橘产业已成为我国南方主产区农村经济的一大支柱产业［1］。由于我国南方栽培柑橘，出现灌溉不均一，偶遇自然灾害（旱、涝）导致柑橘减产，因此，筛选或培育抗旱性强，优质的柑橘砧木资源尤为重要。

聚乙二醇－6000（PEG）用于模拟土壤干旱来研究植物水份亏缺具有较高的实践价值［2］。PEG－6000不易自由通过植物细胞壁，不易渗入活细胞内，不会给植物内增加营养物质，无毒，但能使活细胞缓慢吸水等优点，而常被作为干旱胁迫的渗透胁迫剂［3］，已在苹果、香蕉、枣、樱桃、葡萄、柑橘等果树上广泛应用［4～8］。李志刚等人的研究芦笋在PEG模拟干旱条件下的生理生化变化［9］试验结果表明PEG可有效提高作物抗性功能表达。本试验以绿衣枳壳、旺苍大叶枳为试材，研究柑橘种子在不同浓度梯度PEG模拟干旱胁迫下萌发过程中生理特性的动态变化，为柑橘抗旱性鉴定和抗旱种质的筛选和利用提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 供试材料

以绿衣枳壳、旺苍大叶枳种子为供试材料。绿衣枳壳采种地点为贵阳市花溪区；旺苍大叶枳种子来源于重庆农科院柑橘研究所，采种时间为2013年10月，试验时间为2014年2～4月。

2.2 试验处理方法

选择成熟、饱满且大小一致的种子，经0.50%的次氯酸钠消毒5min，蒸馏水冲洗干净，灭菌滤纸吸干种子表面水分后，均匀摆放在铺有2层滤纸的90mm玻璃培养皿中，每皿30粒种子，分别加入6mL不同水势的PEG－6000溶液，依据 Burlyn［10］等的PEG－6000溶液配制公式，配成0%（为对照ck）、12.5%、17.6%、21.1%的PEG－6000溶液，模拟干旱条件进行处理。绿衣枳壳的0%、12.5%、17.6%、21.1%处理分别命名为 A1、A2、A3和 A4；旺苍大叶枳的0%、12.5%、17.6%、21.1%处理分别命名为 B1、B2、B3和 B4；于25℃恒温培养箱内进行恒温培养，每处理设3个重复。播种后0d、5d、10d、15d进行相关生理生化指标的测定。

2.3 指标测定及方法

α－淀粉酶、SOD、POD、MDA、可溶性糖和可溶性蛋白检测分别采用3，5－二硝基水杨酸比色法、氮蓝四唑（NBT）法、愈创木酚法、硫代巴比妥酸法、蒽酮比色法和考马斯亮蓝染色法，具体见雄庆娥编写的植物生理学实验教程［11］一书。

3 结果与分析

3.1 SOD酶活性的动态变化

SOD是植物体内重要的抗氧化保护酶，它直接影响着活性氧的清除，而细胞对活性氧的清除能力越强，则可避免植物体内过度积累的活性氧对细胞膜和细胞功能的伤害，因此细胞大量产生SOD说明抗性越敏感。两种枳壳种子随着胁迫时间的延长，SOD酶活性出现明显的上升趋势，随着胁迫浓度的提高，SOD酶活性呈现不同程度提高的趋势。在15d检测结果显示不同浓度胁迫枳壳的SOD酶活性变化最大，且绿衣枳壳的SOD酶活性比旺苍大叶枳呈现显著性差异，具体见图1。种子在萌发过程中SOD酶活性也呈现增长趋势，可见SOD酶也随着种子萌发而产生变化。

3.2 POD酶活性的动态变化

由图2可知，随着胁迫时间的延长，POD酶活性呈现逐渐增加的趋势，且两个品种间差异不大。随着PEG胁迫的逐渐增强，种子内部产生了过氧化物酶POD，以清除PEG胁迫中出现的活性氧，从而提高了种子的抗胁迫能力，低浓度短时间的胁迫更有利于POD酶活性的提高。整体比较旺苍大叶枳产生的POD少于绿衣枳壳。

3.3 MDA含量的动态变化

植物脂质过氧化物的产物丙二醛（MDA）是检测植物细胞伤害的一个重要指标，它的含量高低反映植物细胞膜的伤害程度［12］。从图3可看出，两个枳壳种子随着PEG胁迫时间的加深，MDA含量基本保持直线增加趋势。而绿衣枳壳在同一时间、同一胁迫浓度下MDA的含量基本上小于旺苍大叶枳。对照结果表明，随着种子萌发时间的延伸，MDA含量也呈现逐渐增加的现象，说明MDA参与种子萌发的代谢过程。

3.4 可溶性蛋白含量的动态变化

植物体内的可溶性蛋白质大多是参与各种代谢的酶类，在受到干旱胁迫时会发生变化，测定其含量变化是了解植物抗逆性的一种重要方法［13］。由图4可知，可溶性蛋白在一定时期内并没有随着PEG浓度的增加而增加，两个品种0～10d均在一定范围内波动，且两个品种0～5d均呈现下降趋势，胁迫至10d回升至初始状态，检测至15d时各个处理可溶性蛋白含量均有明显增高趋势。干旱胁迫抑制蛋白质的合成并诱导蛋白质的降解，从而使植株体内的总蛋白质含量降低［14］。本研究0～5d结果表明绿衣枳壳与旺苍大叶枳的可溶性蛋白含量下降，与前人研究结果一致。在第5～15d上升的原因可能是在PEG胁迫下，激发了某种特殊的蛋白表达，此现象有待于今后进一步研究。对照结果表明，随着种子萌发时间的延伸，可溶性蛋白基本上没有变化，推论可溶性蛋白较温和参与种子萌发过程。

3.5 α－淀粉酶活性的动态变化

α－淀粉酶是主要的淀粉水解酶，其活性的高低是影响种子萌发的关键因素，在种子萌发时，α－淀粉酶以水作为介质，把种胚中的淀粉分解转化为可溶性糖，若α－淀粉酶不能发挥分解和转化淀粉的作用，种子的萌发则受到抑制。由图5可见，随着PEG胁迫时间的加长，两个枳壳种子的α－淀粉酶的活性呈先上升后下降的趋势，在0～5dα－淀粉酶含量增加迅速，5～10d呈现缓慢增长趋势，10～15d下降且下降趋势较为明显。绿衣枳壳的α－淀粉酶活性低于同一时间、同一胁迫浓度下的旺苍大叶枳。对照α－淀粉酶活性变化保持相对稳定，说明在PEG胁迫下α－淀粉酶发挥作用抑制种子萌发。

3.6 可溶性糖含量的动态变化

可溶性糖是植物体内重要的渗透调节物质，在逆境中其含量会显著增加以调节组织的渗透压，从而提高植物的抗旱能力。图6显示随着PEG胁迫时间的加长，可溶性糖的含量呈上升趋势，对照组的可溶性糖基本上没有变化。绿衣枳壳的可溶性糖含量随时间延伸呈现逐渐升高的趋势，随PEG浓度的升高呈现升高再降低的趋势，可见干旱胁迫也抑制可溶性糖的产生。旺苍大叶枳的可溶性糖含量变化与绿衣枳壳相似，只是品种差异导致同一时期同一浓度旺苍大叶枳的可溶性糖含量低于绿衣枳壳，与α－淀粉酶活性的变化趋势正好相反，即绿衣枳壳的α－淀粉酶活性低于旺苍大叶枳。

4 结论与讨论

PEG模拟干旱胁迫将引起植物一系列的生理特性的变化。本研究表明PEG胁迫对两种枳壳种子保护酶系统、MDA含量、渗透调节物和α－淀粉酶含量都有一定程度的影响。

在正常条件下，植物体内的保护酶和自由基处于平衡状态，但当遭遇逆境时，植物体内会产生过量的自由基和活性氧，对植物细胞造成伤害，但植物会动员保护酶如POD、SOD来清除超出植物本身能够承受的自由基，避免它对细胞膜的伤害，所以保护性酶在保持植物正常发育的过程中起到关键作用。前人研究结果显示保护性酶与植物的抗氧化能力成正比，是评价植物抗逆性的重要标志。本研究中，两个枳壳的SOD、POD变化趋势相似，均随着胁迫浓度和时间的延伸，SOD、POD活性呈明显上升的趋势，干旱胁迫处理的酶活性高于对照，且轻度和中度胁迫与对照相比结果更为显著。

丙二醛（MDA）是膜脂过氧化降解的产物之一，它与蛋白质氨基酸残基反应生成的产物会降低细胞膜的稳定性，导致膜的渗漏，增大了细胞膜的选择透性，使电解质外渗，叶绿体膜、线粒体膜等亚细胞器膜的功能、结构等破坏，导致生理功能的紊乱，MDA含量的增加会加重细胞膜的伤害。本研究表明，绿衣枳壳的MDA含量在同一时间、同一胁迫浓度下小于旺苍大叶枳。抗旱力强的种的细胞膜透性和外渗量小于抗旱力弱的种，所以MDA含量高的树种抗旱力弱，可初步推断绿衣枳壳的抗旱力强。

植物在干旱胁迫条件下会积累渗透调节物质，有效地提高植物渗透调节能力 以增强植物的抗旱性［15］。渗透调节物质包括无机离子和有机物质，其中有机物质有可溶性蛋白、可溶性糖等。可溶性糖含量的增加有利于增强植物的抗旱性，本研究中，随着PEG胁迫时间的延长和胁迫强度的增加，可溶性糖含量逐渐上升，其中以中度胁迫最为敏感，绿衣枳壳的可溶性糖含量始终大于旺苍大叶枳。本研究表明，随着胁迫时间的延长，枳壳种子中的α－淀粉酶活性先增加后减少，在胁迫开始，α－淀粉酶活性增加以提高种子的抗旱力，表现了植物自身的应激反应，但随着PEG胁迫时间的延长，种子失水情况逐渐严重，而α－淀粉酶在行使其功能时又以水为介质，随着种子含水量的下降α－淀粉酶活性也下降。绿衣枳壳的α－淀粉酶活性始终高于旺苍大叶枳，这表明绿衣枳壳的抗旱性更强，这与保护酶系统、MDA含量、渗透调节物的研究所得的结论相同。绿衣枳壳的可溶性糖含量高于旺苍大叶枳，而α－淀粉酶活性低于旺苍大叶枳，这个现象有待今后进一步深入研究。

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