CRISPR/Cas9系统在水稻基因编辑中的应用研究进展

陈伟潘

摘 要 CRISPR/Cas9系统是新一代的基因定点编辑技术，已成功应用于多种物种，例如，人、鼠、果蝇等。简单介绍该技术在水稻中的研究进展。 涉及该系统的启动子、转化方法、突变效率等内容。

关键词 CRISPR/Cas9；水稻；基因编辑

中图分类号：S511 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2015）03--02

基因的准确、便捷、高效率的编辑技术一直是生物分子领域有待解决的难题。2013年，在《SCIENCES》上发表的2篇有关clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated 9（Cas9）系统进行人和鼠基因的定点编辑技术[1-2]，宣告该定点突变技术获得了重大的突破。CRISPR/Cas9系统是继转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）技术和锌指核酸酶（ZFN）之后的新一代的基因定点编辑技术，CRISPR/Cas9系统可准确对基因进行插入或者缺失，从而定点的敲除目标基因。自该系统首次在人类和鼠中进行基因的定点敲除应用成功以来，该系统也被逐渐应用于其他的物种。例如，果蝇、斑马鱼、线虫等[3-4]。本文主要介绍CRISPR/Cas9在水稻中进行基因的定点突变的研究进展。

1 CRISPR/Cas9原理

最新报道的CRISPR/Cas9系统属于Ⅱ型系统，该系统包含crRNA（CRISPR RNA）、tracr RNA（trans-activating crRNA）、核酸内切酶Cas9。Cas9在crRNA与tracr RNA的配合引导下与目标序列特异结合，Cas9的两个结构域HNH和RuvC分别切开双链中的一条单链，产生DNA双链断裂，并启动细胞修复机制，通过非同源末端连接产生基于定点突变。其中，crRNA与tracr RNA可以融合为一个引导RNA（sgRNAs）进行使用。其同样具有和crRNA与tracr RNA配合使用的功能，并且还更方便于载体的构建。

2 CRISPR/Cas9系统在水稻中的应用

水稻作为具有重大经济意义生物，是我国植物分子生物学研究的重点。2013年Zhengyan Feng 等[5]将Cas9系统成功应用于水稻基因的定点突变，其通过将原核生物的Cas9的密码子进行偏好性优化，并用35S启动子驱动Cas9表达，且在Cas9碳端添加核定位信号表达Cas9。使用OsU6-2启动子驱动sgRNA表达分别构建载体，并用农杆菌介相关导载体转化水稻愈伤组织。成功对水稻基因SPP，YSA，ROC5准确地进行了突变。这是首次报道了CRISPR/Cas9在水稻基因定点突变中的应用。同期Jin Miao等[6]报道了将Cas9系统成功应用于水稻基因CAO1和LAZY1的定点突变，与Zhengyan Feng等报道的不同的是，其使用Ubi作为Cas9的启动子，使用U3作为 sgRNA和crRNA：tracrRNA的启动子，且sgRNA和 Cas9构建在一个载体上共转化水稻，这系统看起来具有更高效的突变效果，两个基因的突变率分别达到了83.3%和91.6%。

3 sgRNA的选择

在水稻的应用中，通过比较发现使用sgRNA要比crRNA和tracrRNA配合使用的效率更高[6]。Huanbin Zhou等[7]发现在水稻中具有85 bp尾巴的sgRNA比48 bp的具有更高的突变效率。另外，研究发现高GC含量的sgRNA具有较高的突变效率，因此，在设计sgRNA的时候，应尽可能选择85 bp尾巴且高GC含量的sgRNA。

4 多基因、大片段突变

在水稻的应用中，可以通过基于Gateway技术可以构建同时包含两条或4条sgRNA和Cas9的载体。两条sgRNA分别用不同的U6启动子驱动，在水稻原生质体和愈伤组织中成功使染色体出现大片段的缺失，缺失片段可达245 kb ，该系统还可以用于同时一次性突变4个目标基因[7]，多个基因同时突变不会互相影响。

5 CRISPR/Cas9优点

CRISPR/Cas9具有构建载体简单，特异性高，且可快捷实现多基因甚至大片的敲除，突变位点可以在水稻中稳定地按照孟德尔遗传定律遗传，且低脱靶率等优点[8]。必将对水稻的基因功能的研究，以及水稻的育种应用产生深远的影响，具有广阔的应用前景。

参考文献

[1]Le Cong，F. Ann Ran，David Cox，et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR Cas [J]. Systems Science，2013，339（15）：19-822.

[2]Prashant Mali，Luhan Yang，Kevin M Esvelt et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9[J].Science，2013，339（15）：823-825.

[3]Ari E Friedland，Yonatan B Tzur，Kevin M Esvelt，et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system[J]. Nature Methods，2013，10（8），741-743.

[4]Nannan Chang，Changhong Sun，Lu Gao，et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in Zebrafish embryos[J].Cell Reasearch，2013，23（4）：465-472.

[5]Zhengyan Feng，Botao Zhang，Wona Ding，et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system[J].Cell Rearch，2013，23（10）：1229-1232.

[6]Jin Miao，Dongshu Guo，Jinzhe Zhang，et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas [J].system，2013，23（10）： 1233-1236.

[7]Huanbin Zhou，Bo Liu，Donald P. Weeks，et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice[J].Nucleic Acids Research，2014，42（17）： 1233-1236.

[8]Hui Zhang，Jinshan Zhang，Pengliang Wei，et al. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation[J].Plant Biotechnology Journal，2014，12（6）： 797-807.

（责任编辑：赵中正）