环介导等温扩增(LAMP)试剂盒检测石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)

周冬青 刘成永△ 王 骥 王春颖 张克球 刘加彬 黄海滨 候远沛 成 松 王 鑫

(1江苏省徐州市传染病医院检验科,2肝炎科 徐州 221004)

环介导等温扩增(LAMP)试剂盒检测石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)

周冬青1刘成永1△王 骥2王春颖2张克球2刘加彬2黄海滨2候远沛1成 松1王 鑫1

(1江苏省徐州市传染病医院检验科,2肝炎科 徐州 221004)

目的 建立一种检测石蜡包埋的肝组织中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的新方法,并探讨其应用价值和临床意义。方法 提取30例慢性HBV感染患者的石蜡包埋肝组织中的DNA,采用质粒安全ATP依赖性DNA酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase,PSAD)消化,去除非cccDNA后,加入引物及Bst DNA酶进行环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),将检测结果与临床实验室资料结合并进行分析,以判断其临床应用价值。结果 30例HBV感染患者中,有17例HBV cccDNA阳性,阳性检测率56.67%。其中肝癌5例、肝硬化4例、重型乙型肝炎5例、慢性乙型肝炎(轻-中度)3例。提示肝组织HBV cccDNA阳性可能与疾病进展密切相关,与血清HBV cccDNA阳性有一定的相关性,与乙型肝炎病毒血清免疫标志物以及肝功能状况无明显相关。结论 LAMP法能检测到石蜡包埋肝组织中的HBV cccDNA,结合临床实验室资料,对判断抗病毒药物疗效及研究乙型肝炎致病机制具有一定的意义。

环介导等温扩增(LAMP); 乙型肝炎病毒(HBV); 共价闭合环状DNA (cccDNA)

共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是乙型肝炎病毒(chronic hepatitis B virus,HBV)转录的模板,也是HBV持续感染的重要因素[1]。在感染和抗病毒药物治疗过程中,HBV cccDNA在肝细胞中稳定存在[2],尽管cccDNA是致病的关键因素,但难以明确其在肝细胞中存在的机制[3]。研究HBV cccDNA的障碍是肝活检组织不易得(肝活检属于有创性检查),加之目前的检测方法尚不完善(国内尚无正式批准用于临床的检测试剂)。本研究试图利用病理科剩余的石蜡包埋肝活检标本,建立一种经济、简便的新型HBV cccDNA检测方法,以达到节约成本、减轻患者痛苦(患者不需要再次进行肝活检)的目的,从而为诊断及治疗提供参考。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种简便、快速、准确的恒温扩增方法,能在60～65 ℃下、30～60 min内将2～3拷贝的靶核苷酸扩增到1×109。本研究收集30例慢性HBV感染患者的病理科常规检测剩余的石蜡包埋肝组织,以3例非HBV感染者作为阴性对照,使用LAMP法检测HBV cccDNA,并将检测结果与临床实验室资料相结合,进行回顾性研究,探讨LAMP在石蜡包埋肝组织HBV cccDNA检测中的应用及临床意义。

材 料 和 方 法

样本来源 33例石蜡包埋肝组织来源于2012年至2014年徐州市传染病医院肝炎科就诊患者,其中慢性HBV感染者30例,1例酒精肝硬化患者和2例乙肝免疫标志物全阴的丙型肝炎患者作为阴性对照。参考《2010年病毒性肝炎防治指南》[4],30例慢性HBV感染者诊断明确,其中肝癌8例,肝硬化10例,慢性乙型肝炎9例,表面抗原携带者3例;男性24例,女性6 例,年龄28～65岁,平均年龄46.5岁。

仪器及试剂 石蜡切片机及切片刀(德国莱卡公司)、1.5 mL离心管、移液枪、一次性枪头、快速石蜡组织DNA提取试剂盒(北京天恩泽生物公司)、质粒安全ATP依赖性DNA酶(plasmid-saft ATP-dependent DNace,PSAD)试剂盒(美国Epicentre公司)、LAMP通用型试剂盒(日本荣研化学株式会社)、金属浴、HBV DNA荧光定量检测试剂盒(厦门安普利公司)LAMP引物由上海生工合成。

石蜡包埋肝组织中DNA的抽提 切取 5～8片肝组织石蜡切片(厚度6 μm),放入1.5 mL的EP管中,使用快速石蜡包埋组织DNA提取试剂盒抽提肝组织中的DNA,具体操作步骤按说明书进行,主要包括组织的裂解、吸附柱吸附DNA、洗涤纯化及洗脱,抽提的DNA分装后于-20 ℃保存。

PSAD纯化cccDNA 为了将cccDNA与rcDNA和单链DNA分离,采用酶切法对抽提产物进行纯化。由于cccDNA对PSAD具有抵抗作用,采用PSAD去除非cccDNA,而保留cccDNA。PSAD试剂盒的主要操作方法:取10×缓冲液 2.2 μL、ATP 0.8 μL、PSAD 0.2 μL (2 U)加入6.8 μL抽提的DNA中,使总体积为10 μL,37 ℃下30 min去除非cccDNA,70 ℃下10 min灭活PSAD,终止反应。

LAMP法扩增HBV cccDNA 采用LAMP法扩增HBV cccDNA,所用的5条引物是针对HBV DNA与HBV cccDNA存在结构差异的6个区段(F1、F2、F3、B1、B2、B3)而设计的4条嵌合引物(FIP、BIP、F3、B3),以及在B1区段与B2区段之间导入1条具有互补序列的环状引物LB,以增加DNA合成的起点(通过应用环引物,所有含环状结构的单链都能用作扩增起点)。采用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA。LAMP法以特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在1 h内能扩增出1×109靶序列拷贝[5]。严格按照LAMP试剂盒说明书操作,取2×缓冲液[含DNTP、Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween 20、Betaine混合液]、稀释后的5条引物、BstDNA聚合酶、经PSAD纯化的DNA及双蒸水,总体积为30 μL,充分混匀,置于金属浴或实时浊度仪中,63 ℃下30～60 min扩增DNA,80 ℃下5 min灭活Bst DNA聚合酶,终止反应。

结果判定 扩增结束后将检测样本与阳性对照一同放在明亮光线下进行观察,混浊为阳性,透明为阴性;使用实时浊度仪根据浊度变化进行定量。

结 果

30例慢性HBV感染患者中有17例HBV cccDNA阳性,占总样本的56.67%,其中肝癌5例、肝硬化4例、重型乙型肝炎5例、慢性乙型肝炎(轻至中度)3例;5例乙型肝炎重型患者均为阳性,8例肝癌患者中有5例为阳性,而3例表面抗原携带者均为阴性,提示肝组织HBV cccDNA阳性可能与病情进展密切相关。

17例HBV cccDNA阳性患者中血清HBV DNA阳性者有10例(阳性率58.8%)。血清HBV DNA阳性者HBV cccDNA阳性机率高于血清HBV DNA阴性者,提示肝组织HBV cccDNA阳性与血清HBV cccDNA阳性可能有一定的相关性。然而,另有40%患者虽然血清HBV cccDNA阴性,但其体内仍然存在HBV cccDNA。

17例HBV cccDNA阳性患者中HBsAg、HBeAg、HBcAb均为阳性者有8例,所有阳性患者均为HBsAg阳性,而肝功能异常患者有7例,提示肝组织HBV cccDNA阳性可能与HBsAg密切相关,而与HBeAg、HBcAb以及肝功能状况无明显相关性。

阳性对照HBV cccDNA检测结果均为阳性,阴性对照均为阴性。

讨 论

LAMP法能检测到石蜡包埋肝组织中的HBV cccDNA,结合临床实验室资料进行分析,对判断抗病毒药物疗效及研究乙型肝炎致病机制具有一定的意义。

近年来HBV cccDNA逐渐成为研究的热点,但是目前对于HBV cccDNA的研究和开发尚属初步阶段。检测技术难度较大;前期研究主要集中于细胞模型和肝脏模型,不能满足临床检验的需求;而现有检测技术的灵敏度不高,检测低限为1×104拷贝/mL;部分研究机构和学者对检测技术的特异性认识不足。而cccDNA的检测又有许多难点问题尚未解决,多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、rcDNA、ssDNA、HBV整合的DNA),必须将cccDNA与其他DNA有效分离,才能提高检测的特异性。由于细胞内cccDNA含量较低,仅为5～60拷贝/细胞,必须提高敏感性才能达到检测的目的,为进一步完善检测技术并解决难点问题,提高HBV cccDNA应用价值及发展前景,我们收集病理科常规检测剩余的石蜡包埋肝组织并进行核酸提取,利用PSAD 分离纯化cccDNA,以提高检测的特异性。为了进一步提高检测的特异性及敏感性,我们根据HBV cccDNA与rcDNA结构上的差异,利用环介导引物设计软件设计了1对外引物、1对内引物和1条环状引物,并利用Bst DNA聚合酶(该酶特异性较高,扩增效率也较高)对cccDNA进行LAMP。Notomi等[6]明确指出LAMP法对于扩增靶序列具有高度的敏感性。鉴于LAMP法具有简便、快速、准确的特点,而且无需PCR仪器,只需一台恒温水浴箱或恒温金属浴,15 min至1 h即可成扩增,从提取DNA 到扩增结束,整个过程3 h内即可完成,扩增产物量大,适合简易型检测[7-10],可以在基层单位推广使用。

目前HBV cccDNA的检测方法有以下几种:(1)选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR):根据HBV DNA与HBV cccDNA结构上的差异,通过设计一对特殊的跨双缺口引物,选择性扩增cccDNA,松弛环状的rcDNA则不被扩增;但可能由于PCR产物自身退火而导致失误。(2)实时荧光定量PCR[11]:与定性方法相比较,其增加了与cccDNA负链(rcDNA负链缺口下游)互补的荧光探针,使cccDNA能够检测到扩增信号而rcDNA则不能被检测,但同样存在PCR产物自身退火而引起松弛环状的(rcDNA)被扩增的现象,且在HBV cccDNA>1×108拷贝/mL时容易出现假阳性。(3)侵入探针法:使用侵入探针和引物探针,通过裂解酶特异性切割5′端碱基片段使之与荧光共振能量转移盒结合,裂解酶再切割荧光共振能量转移盒上荧光基团的短臂,发出荧光信号。特点是一个模板可重复使用,结合-裂解-结合-裂解,循环一次产生一次信号,呈线性信号放大。优点是特异性较强,缺点是敏感性较差,低于1×104拷贝/mL无法检测。(4)滚环扩增联合荧光定量扩增法[12]:有学者提出用phi29酶(只扩增环状DNA的一种酶)来扩增环状的cccDNA,然后用荧光定量来检测。优点是特异性、敏感性均较高;由于滚环扩增是在恒温的状态下进行16～18 h的扩增,因此耗时较长,且phi29酶的价格亦较昂贵,用于临床可能会增加患者的负担。(5)原位滚环扩增法:为使扩增的HBV cccDNA能够直观可见,石蜡包埋的肝组织切片用PSAD消化后,再用原位滚环扩增联合原位PCR的方法检测肝组织中的HBV cccDNA[13]。此法虽然证实了肝组织中确实存在HBV cccDNA,具有直观、可靠、形象的优点,但只能定性和相对定量,检测结果不能达到量化标准,因此精确度有限,而且原位滚环扩增对技术要求过高,且操作繁琐,直接用于临床的难度较大。以上各种扩增技术需要专门的PCR仪或者原位PCR仪,本研究所用的LAMP试剂盒检测HBV cccDNA的方法与之相比,操作简单,省时省力,而且不需要专门的PCR仪器,使用LAMP实时浊度仪还可以达到定量的目的,加入钙黄绿素,通过荧光可以使检测结果的目视效果更清晰。

本研究发现17例HBV cccDNA阳性患者中有5例乙型肝炎重型患者,这一方面说明肝组织大量坏死可能导致肝细胞释放HBV cccDNA增多,另一方面也说明重型乙型肝炎患者体内HBV DNA复制活跃,导致进入肝细胞核的HBV DNA增多,形成的HBV cccDNA数量增多,因为HBV cccDNA是HBV DNA复制的间接模板,又进一步促成HBV DNA 复制增多,导致乙型肝炎病毒数量增加,进一步加重对肝脏的损伤。8例肝癌患者中5例为HBV cccDNA阳性,10例肝硬化患者中4例为HBV cccDNA阳性,提示HBV cccDNA阳性可能与疾病进展密切相关,其在“乙型肝炎-肝硬化-肝癌”进展中发挥了重要的作用,同时也说明HBV cccDNA 是乙型肝炎持续性感染过程中的重要因素。17例HBV cccDNA阳性患者中10例血清HBV cccDNA为阳性,另有7例患者(40%)虽然血清HBV cccDNA为阴性,但患者肝组织HBV cccDNA检测为阳性,说明其体内仍然存在HBV cccDNA,这一方面可能与HBV DNA变异有关,另一方面可能与患者应用抗病毒药物有关。目前的抗病毒药物主要针对HBV DNA,对于HBV cccDNA作用有限,只能通过间接减少进入胞核内的HBV DNA使HBV cccDNA逐渐耗竭,当抗病毒药物应用时间较短时,外周血HBV DNA下降较为明显,而肝组织HBV cccDNA下降相对缓慢。3例表面抗原携带者均为阴性,一方面说明患者免疫耐受,另一方面说明患者体内HBV DNA复制率较低,而这种复制率低可能恰恰是因为肝组织内HBV cccDNA含量低,HBV DNA由于间接模板减少而导致复制力下降。赵克开等[14]认为即使慢性乙型肝炎患者血清HBsAg清除,由于肝组织中少量HBV cccDNA 的存在,部分乙型肝炎仍有复发的可能,因此建立一种敏感性和特异性较好的简便的肝组织HBV cccDNA检测方法,对于评价乙型肝炎抗病毒药物疗效、判断病情及预后具有一定的意义。

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A detection method of the loop-medidated isothermal amplification (LAMP) kit for hepatitis B virus (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA) in paraffin embedded liver tissues established

ZHOU Dong-qing1, LIU Cheng-yong1△, WANG Ji2, WANG Chun-ying2, ZHANG Ke-qiu2, LIU Jia-bin2, HUANG Hai-bin2, HOU Yuan-pei1, CHENG Song1, WANG Xin1

(1ClinicalLaboratory,2DepartmentofHepatitis,XuzhouInfectiousDiseaseHospital,Xuzhou221004,JiangsuProvince,China)

Objective To establish a novel method for detecting hepatitis B virus (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA) of paraffin embedded liver tissues,and to discuss its application value and clinical significance. Methods The extraction DNA of 30 patients with chronic HBV infection in paraffin embedded liver tissues was digested by plasmid-safe ATP-dependent DNase (PSAD).Non cccDNA was removed, and then the necessary primers and Bst DNA polymerase were added together for loop mediated isothermal amplification (LAMP).The detection results combined with clinical laboratory data were analyzed to estimated its clinical application valus. Results Among the 30 HBV infected patients,17 cases were detected as HBV cccDNA positive with the positive detection rate of 56.67%,of which 5 cases were liver cancer,4 cases were cirrhosis,5 cases were severe chronic hepatitis B,and 3 cases were mild to moderate charonic hepatitis B.It revealed that positive HBV cccDNA might have a close link with the progress of the disease,also had a certain correlation with the serum HBV DNA loading,but had no obvious correlation with HBV serum markers and liver function.Conclusions LAMP detection method can indicate HBV cccDNA in the paraffin embedding liver tissue,which combined with clinical laboratory data has a certain significance in judging the antiviral efficacy and researching pathogenic mechanism of HBV.

loop-mediated isothermal amplification (LAMP); hepatitis B virus (HBV); covalently closed circular DNA (cccDNA)

R 373.2+1

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.02.018

2014-10-17;编辑:段佳)

△Corresponding author E-mail:crblt@126.com