小肠黏膜下层细胞及内皮细胞平滑肌细胞构建组织工程血管的初步研究*

王 飞，魏红芳，胡成栋，张恩录，高爱芹，王 瑞，李东风

(河北省邯郸市中心医院：1.骨科；2.麻醉科 056001)



·临床研究·

小肠黏膜下层细胞及内皮细胞平滑肌细胞构建组织工程血管的初步研究*

王 飞1，魏红芳2，胡成栋1，张恩录1，高爱芹1，王 瑞1，李东风1

(河北省邯郸市中心医院：1.骨科；2.麻醉科 056001)

目的 初步探究小肠黏膜下层(SIS)细胞及内皮细胞、平滑肌细胞构建组织工程血管的实验方法、条件及可行性。方法 取20只家兔(6～8周大)，于体外分离培养内皮细胞、平滑肌细胞并标记，最后进行组织工程化血管的自体移植。结果 实验结果表明于培养板中合成的支架材料呈现为白色、均匀质地；内皮细胞及平滑肌细胞可较好附着并植入SIS材料。结论 小肠SIS及内皮细胞、平滑肌细胞构建组织工程血管具有可行性，并具有十分重要的医学应用价值。

小肠黏膜； 下层细胞； 内皮细胞； 平滑肌细胞

天然血管具备天然成分及结构并具有良好的生物相容性，可以提供细胞需要的各种信号[1]，同时也可以有效促进细胞的黏附和保留分化功能。因此，天然血管是组织工程血管支架的最佳材料。小肠黏膜下层(SIS)是天然细胞外基质类生物衍生材料，通常由猪小肠制备，人工处理后的SIS主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及少量Ⅴ、Ⅵ胶原构成，制备的SIS厚度约80 μm，具有无免疫原性、抗微生物活性、优良的生物力学性能，并能促进组织再生，是组织工程细胞外基质很有前途的生物材料[2-3]。在此基础上，以异种SIS为细胞外基质预构成三维管道，将内皮细胞与平滑肌细胞在三维管道上联合培养，复合构建组织工程化血管的设想，在国内外杂志未见相关报道，其可行性值得探索。

1 资料与方法

1.1 一般资料 实验动物：20只6～8周家兔；主要的试剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)、含氯化钠(NaCl)的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液、含0.05%叠氮化钠的PBS溶液、胶原酶、乙酰胆碱、氯化钾及硝普钠等；主要的仪器：F12培养基、DMEM培养基、光镜、扫描电镜荧光显微镜或细胞流式仪等。

1.2 方法

1.2.1 猪小肠黏膜下层的制备与检测 (1)制备：取健康猪的空肠长约10 cm，冲净，机械法去除外面的浆膜层与肌层，翻转后去除黏膜层，纵向切开黏膜下层基质，浸泡于100 mmol/L EDTA与10 mmol/L NaOH(pH 11～12)溶液中，去离子水冲净；再浸泡于1 mol/L HCl与1 mol/L NaCl溶液中6～8 h，去离子水冲净，在含1 mol/L NaCl的PBS溶液(pH7.0～7.4)中浸泡16 h，去离子水冲净，在PBS溶液中浸泡2 h，去离子水冲洗2 h，0.2%过氧乙酸(含5%无水乙醇)消毒30 min，在含0.05%叠氮化钠的PBS溶液清洗2 h，用2.5×10-5Gy γ射线照射。(2)光化学交联剂固定处理后，进行光镜、扫描电镜及免疫组化检测，验证其脱细胞情况。(3)由于SIS黏膜面较浆膜面有更低的孔隙率，因此将SIS黏膜面朝内包绕细玻璃棒上，于显微镜下应用9/0无创线缝合出直径为2 mm、长约20 mm管状基质，在体外检测其生物力学性能，包括平均破裂压、弹性模量及纵向的屈服应力。处理后的管状脱细胞基质以玻璃化法保存。

1.2.2 猪小肠黏膜下层基质抗原性检测 将处理后的猪小肠黏膜细胞基质，切取1 cm2植入家兔皮下组织，7 d后取材，于光镜、免疫组化检测脱细胞基质在家兔体内的免疫反应情况。如有条件可行单克隆抗体检测家兔单核淋巴细胞黏附蛋白(CD18)。

1.2.3 内皮细胞与平滑肌细胞分离与培养 (1)无菌条件下取家兔自体大隐静脉，去污，胶原酶灌流消化，采集内皮细胞进行传代培养，应用荧光显微镜或细胞流式仪进行细胞鉴定；(2)采用类似方法对平滑肌细胞进行分离、培养与鉴定。

1.2.4 内皮细胞与平滑肌细胞种植与拟生态环境下培养 (1) 取传代培养2～3代的内皮细胞，胰蛋白酶消化、离心漂洗后，种植内皮细胞于1 cm2的猪SIS基质上，培养鉴定内皮细胞能否在此基质上成活。(2)生态环境动态旋转反应器的制备：血管细胞在生理条件下，受到流体切变应力、管壁舒缩产生的牵张应力以及静水压等应力，这些应力环境对于血管细胞的形态、增殖、极性及基质构成与结构有着重要影响。参考相关资料，制备简便有效、适于血管灌注培养的动态旋转反应器。(3)内皮细胞与平滑肌细胞种植：取2 cm制备好的直径为2 mm管状SIS基质置于反应器内，接种内皮细胞，在37 ℃与5%CO2条件下孵化，动态培养液灌注，第2天应用微型注射器将平滑肌细胞多点随机注射入管状脱细胞基质内，继续动态培养4周。培养期间，定期进行细胞计数器计数、光镜、电镜及免疫组化检测基质内细胞量及活性。

1.2.5 组织工程化血管生物学及生物力学性能检测 (1)应用乙酰胆碱、氯化钾、硝普钠等药物，比较正常股动脉与工程化血管间生物学方面的差别；(2)检测正常股动脉与工程化血管平均破裂压、弹性模量及纵向的屈服应力，比较SIS基质、正常股动脉、工程化血管三者间生物力学方面的差别；(3)通过光镜、电镜及免疫组化检测，比较正常股动脉与工程化血管二者形态学方面的差别。

1.2.6 组织工程化血管的自体移植 (1)管状SIS基质种植细胞后2周，经鉴定细胞成活后，分别取自体股动脉及管状SIS基质为对照，行工程化血管移植(均不行全身抗凝药物治疗)，于1、2、4、8周定期取材，应用乙酰胆碱、氯化钾、硝普钠等药物，比较正常股动脉与工程化血管间生物学方面的差别；并行大体、光镜、电镜及免疫组化检测，观察其血管通畅率、形态学及免疫相容性，以确定其可行性。(2)取管状SIS基质行血管替代，以自身为对照(均不行全身抗凝药物治疗)，定期取材检测，在血管通畅率、形态学及免疫相容性等方面，与组织工程血管相比较。

2 结 果

2.1 大体观察结果 于培养板中合成的支架材料呈现为白色、均匀质地，所合成的组织工程管形支架材料，外径大小为6 mm，内径大小4 mm，长度为3 cm左右，且有韧性及弹性。

2.2 接种时细胞形态的观察结果 贴附于SIS材料上的人体血管内皮细胞和平滑肌细胞经倒置显微镜观察显示为细胞胞体透亮，呈现为球形并均匀地分布在SIS材料表面。

2.3 免疫组织化学观察结果 SMA抗染色体观察的结果显示：内皮细胞及平滑肌细胞能够渗透于SIS材料之中，并最终形成数层有规律的细胞结构。

3 讨 论

目前全世界每年大约有20万例周围血管移植，自体血管移植是迄今最理想的替代物，但由于：(1)自体静脉血管本身结构上与动脉存在差异；(2)静脉本身具有较高的病变率；(3)长度与来源合适的自体非必需血管来源有限；(4)以创伤修复创伤的治疗模式增加患者痛苦等缺点，而限制其应用[4]。人工合成材料的发展使人工大血管的替代成为现实，但材料生物相容性与血管顺应性差、昂贵的价格、抗凝药物长期应用的不良反应以及小管径血管通畅率很低等条件，使其仍需不断改进[5]。组织工程技术在血管方面的应用，以其高度组织相容性、抗凝性、抗感染及可生长性，为血管的替代与重建展示了美好的前景[6-8]。但是在种植细胞的研究、细胞外基质以及病损组织替代等方面仍有诸多问题急需解决。

Matsumoto于1967年首先提出应用SIS作为血管组织补片后，各国学者就开始不断探索SIS作为血管移植物的研究。相关研究表明：(1)SIS血管较ePTFE有更强的抗感染力，其浸提液能够抑制多种细菌生长[9]；(2) SIS有比自体血管更强的再生能力，虽然血管顺应性无明显变化，但2个月后SIS移植物壁厚较原来增厚10倍以上，随着SIS退变与吸收，按照血管生理与力学的要求不断改造[10]；(3)SIS对于5～8 mm口径血管进行移植后，生物力学检测显示移植物获得力学重建；(4)以SIS为体外细胞培养底物，对6种细胞进行不同形式的培养，结果显示联合三维培养更有利于再现细胞生理特性[11]；(5)SIS在纵轴方向的抗拉强度为肌腱与韧带的1/7～1/14，并且弹性大，适于作为血管的替代材料等[12]。

综上所述，SIS及内皮细胞、平滑肌细胞构建组织工程具有可行性，并具有十分重要的医学应用价值。

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河北省邯郸市科技计划项目(1223108090-3)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.033

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2014-09-16)