趋化素样因子1在血管再狭窄中的作用及体外迁移实验研究进展

陈 峰，张 韬，郭 伟解放军总医院 血管外科，北京 00853；北京大学人民医院 血管外科，北京 00044

动脉粥样硬化引起的外周动脉疾病(peripheral arterial disease，PAD)是仅次于冠心病和卒中的最常见的血管疾病，全球70岁以上人群患病率超过了10%[1]。对于PAD患者的管理，目前美国心脏病学学院基金会/美国心脏协会指南推荐的手段主要是基础治疗和手术治疗，手术治疗借助于动脉旁路移植术、动脉内膜剥脱术、经皮腔内血管成形术/支架置入术[2]。无论哪种手术方法，都存在20%～30%的血管再狭窄(restenosis，RS)并发症，严重影响该病治疗的远期疗效[3-4]。RS发生的核心机制之一为炎性细胞和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在趋化因子，如趋化素样因子1(chemokine like factor 1，CKLF1)、单核细胞趋化因子1(macrophage chemoattractant protein 1，MCP-1)、Fractalkine等介导下的迁移[5-7]。CKLF1是北京大学人类疾病基因研究中心应用抑制性减数杂交技术克隆出的一个新细胞因子，与MCP-1在结构上具有同源性[6,8]。体内和体外实验证实其具有广谱的趋化活性，而且能够促进骨骼肌细胞、骨髓造血干/祖细胞的增殖和分化[8-9]，与心血管疾病也存在着密切关联[10-11]。传统研究方法发现CKLF1具有诱导VSMC增殖和抗凋亡的双重作用[12]，还能促进VSMC定向迁移[13]。本文主要介绍CKLF1在RS形成过程中的作用机制，并综述既往相关的体外迁移研究实验。

1 CKLF1在RS病程中的作用

近半个世纪以来，对RS机制的探究始终未曾停止。多数研究认为，炎症损伤和免疫反应贯穿于整个病变过程，血管重建造成了内皮损伤，病变处血管的扩张或全层离断使中膜弹性纤维层的破坏延伸到外膜，血管壁损伤会导致局部微血栓形成和炎症反应发生，进而在众多细胞因子[(MCP-1、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colonystimulating factor，M-CSF)、γ-干扰素、肿瘤坏死因子-α、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)]的作用下使VSMC过度增殖，促进细胞外基质增多并同VSMC一起向内膜迁移，最终共同构成了增生的内膜组织，引起了RS的发生[14-20]。

趋化因子是一类调控细胞定向迁移的重要细胞因子，根据结构可以分为C、CC、CXC、CX3C亚族。目前，已发现与RS相关的趋化因子主要包含CC亚族中的MCP-1/MCAF、MIP-1α、MIP-1β，CXC亚族中的PAF、IL-8、GRO以及CX3C家族的Fractalkine等，其受体(XCR1、CCR1 ~ 11、CXCR1 ~ 5和CX3CR1)多属于G蛋白偶连受体超家族[6-7]。新细胞因子CKLF1具有CC家族趋化因子的特征性结构，通过HEK293细胞实验发现其受体之一是CCR4[21]。CKLF1不仅能够趋化嗜中性细胞、单核细胞和淋巴细胞，而且可以刺激小鼠骨骼肌细胞的增殖，以及促进人和小鼠骨髓造血干细胞的增殖和分化[8-9]。有报道称其还能调控单核细胞向树突状细胞的转化[22]。动物实验发现，CKLF1可以改善大鼠急性心肌梗死后心脏功能，有助于心肌修复[23]。目前CKLF1与血管疾病关联的研究较少。笔者之前的研究中[24]推测CKLF1协同基质金属蛋白酶参与了腹主动脉瘤的发病，氢水治疗可以有效阻断前述病理进程。宣成睿等[13,25]分别发现人CKLF1质粒瞬时转染的COS7和293T细胞培养上清液对VSMC具有趋化和促增殖作用，且该作用依赖于Gi蛋白偶联受体。同样的促增殖和迁移作用也表达在主动脉内皮细胞上，推测CKLF1具有促进新生血管形成的功能[26]。CKLF1与MCP-1在结构上具有同源性，且在大鼠主动脉损伤模型中，发现内膜组织中CKLF1与MCP-1在表达上存在高度正相关性，提示CKLF1在RS过程中可能与MCP-1发挥相似的功能[27]。

在对CKLF1促进VSMC迁移作用的系列研究中，多位研究人员均证实CKLF1参与了VSMC迁移过程，是发生RS的危险因素：1)人动脉硬化斑块的内皮细胞、VSMC和巨噬细胞皆可表达CKLF1，其表达量较正常动脉显著上调，斑块中CKLF1、巨噬细胞和VSMC共定位存在，推测CKLF1在招募炎症细胞，刺激VSMC迁移等RS关键步骤上可能起到了某种特殊的作用[12,28]。2)通过腺病毒和shRNA技术干扰CKLF1基因表达，在体外实验中发现CKLF1促VSMC迁移功能分别得到增强和减弱，在大鼠颈动脉局部损伤的体内实验中对应的内膜增生变化趋势与体外实验一致[28]。3)通过CKLF1的小分子多肽C19和化合物抑制剂S009阻断VSMC上的CCR4受体，发现CKLF1引起的作用发生了改变[29]，提示CCR4是CKLF1的受体之一，这一现象与王应和马大龙[21]的研究结论基本一致。4)VSMC转染CKLF1后，内含核因子(nuclear factor，NF)-κB的表达总量被增强，推测NF-κB信号通路参与了CKLF1介导VSMC生物学功能的调控[30]。由此可见，CKLF1在RS的发展过程中起了重要作用，遗憾的是，目前CKLF1对VSMC作用机制尚无更深入研究，如受体变化、信号转导、表型转化和转录因子等层面，因而制约了其药物拮抗靶点和临床应用价值的开发利用。

2 体外迁移实验

在CKLF1对RS发生机制的研究中，VSMC迁移是基本实验模型。影响VSMC迁移的因素很多，包括各种生长因子、趋化因子、流体应力等。为探索多因素介导VSMC迁移的机制，重复性好、可信度高的体外研究是十分必要的。传统研究中VSMC迁移主要依赖于划痕法和细胞趋化小室(Boyden Chamber)等经典技术。前者是在孔板上，当VSMC贴壁长满时用移液枪头或刀片刮除一定范围的细胞，观察细胞向刮除细胞区的迁移运动。一般以某一细胞群的最大迁移距离为参数分析VSMC迁移能力。该方法操作简单，直观，备受实验人员青睐，但其划痕速度和尺寸一致性较差。在划痕过程中，细胞受到机械性损伤，并释放细胞内容物于周围环境，且细胞损伤程度不可控，导致迁移过程复杂多样。另外，瓶皿表面修饰分子层会被划痕破坏，上述问题说明该技术可重复性较差。后者以8μm孔径滤膜为分界，将VSMC接种至上层小室，下室加入不同诱导物，于不同时间点取出滤膜擦掉膜正面的细胞后，固定、染色，在显微镜下计数膜背面视野中的细胞数，也可以在电镜下观察VSMC跨膜的过程。但细胞趋化小室技术只能模拟VSMC在单一浓度、稳态溶液环境中的反应，而体内环境中VSMC迁移是一个多因素调控的复杂病理生理学过程。更为重要的是，相对于血管壁的微小尺寸，这些胞外环境与体内微环境差异十分明显，客观上难以真实反映生理状态下VSMC的生物学特征。因此，需要能更好模拟活体血管壁微环境并具有对活细胞从时间上和空间上进行精确操作的细胞研究装置。

微流控芯片又称为“芯片实验室”，是通过半导体集成技术制成的新型固体元件，可对微量流动细胞进行复杂、精确的操作，该项技术与基因芯片技术并称为21世纪最有发展前景的新技术。在基于微流控技术的细胞研究领域中，早在2006年《Nature》上就有针对微流控细胞培养芯片的相关综述：包括芯片材料选择、建立微环境、片上培养、细胞检测等[31]。2014年《Nature》上进一步综述微流控技术在肿瘤细胞、骨细胞、干细胞、内皮细胞等领域的重要应用[32]。在基于微流控技术的细胞迁移研究中，Whitesides最早提出利用微流控技术的层流特性，在微沟道中产生溶液浓度梯度和束缚在衬底上的大分子密度梯度[33-34]。其优势是梯度定量可控，不仅产生线性梯度而且可以产生稳定多样的梯度，更好地模拟细胞微环境。使用这一技术，量化了炎症细胞[35]、肿瘤细胞[36-37]、小肠上皮细胞在不同梯度下的迁移[38]。Wong在Whitesides设计的“圣诞树”结构基础上，通过控制交联剂浓度梯度实现了束缚于衬底表面的硬度梯度[39]。Ladoux使用微流控技术制作微阵列，通过调整微柱的尺寸，同样实现了衬底表面的硬度梯度[40]。Du等[41-42]化繁为简，摒弃了传统微流控技术中的导管和泵，采用滑动芯片法，在微沟道中产生溶液浓度梯度。与传统方法比较，微流控技术不仅可以“真实”模拟细胞外环境，还能构建细胞级精度的浓度梯度、分子密度梯度、硬度梯度等，成为细胞层面机制研究的优势平台。

3 结语

CKLF1在RS的病理过程中具有重要作用，CKLF1调控VSMC迁移过程，是发生RS的危险因素。然而，CKLF1对VSMC的研究尚无深入到受体变化、信号转导、表型转化和转录因子等层面，现象表征的模型缺陷也制约了VSMC在趋化因子作用下迁移机制的研究，此方面空白亟需填补，以期对RS的治疗开拓新的思路和方案，并且基于高通量方法，可以提高体外实验进行心血管药物筛选的成功率。

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